Rho/ROCK信號通路參與多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)及其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomylitis,EAE)的病理過程,在免疫細胞活化、炎性細胞經(jīng)破壞的血-腦屏障(blood brain barrier,BBB)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)遷移、髓鞘脫失、軸索損害以及膠質(zhì)細胞反應等方面扮演著重要的角色。鹽酸法舒地爾(Fasudil)是目前臨床用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣的Rho激酶(Rho kinase,ROCK)抑制劑。有研究表明鹽酸法舒地爾具有改善EAE免疫炎性微環(huán)境、保護髓鞘等作用,且具備促進神經(jīng)突觸再生的能力和內(nèi)源性神經(jīng)干細胞動員的潛能。但是,鹽酸法舒地爾同時存在著迅速明顯的血管擴張作用、長期使用安全窗較小且給藥途徑單一、口服生物利用度差、半衰期短等局限性。因此尋求和研發(fā)更有效、更安全且副作用更小的新型ROCK抑制劑來治療神經(jīng)系統(tǒng)慢性病的任務就顯得越來越迫切。羥基法舒地爾(Hydroxyfasudil,HF)是鹽酸法舒地爾在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物,活性比鹽酸法舒地爾強,半衰期更長,并且作為ROCK抑制劑,HF具有更高的選擇性。動物實驗表明其在惡性腫瘤、肺動脈高壓、心腦血管痙攣、心肌缺血、缺血性腦損傷等疾病的預防和治療中具有潛在價值。因此,在本研究中首先于細胞水平檢驗HF的細胞毒性、對神經(jīng)元活性以及形態(tài)的影響;其次,通過小鼠急性毒性實驗,驗證其安全性并了解HF的最大耐受劑量(Maximum Tolerance dose,MTD);繼之,在EAE模型驗證HF的臨床有效性;最后,比較HF以及鹽酸法舒地爾在雙環(huán)己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)誘導的CNS脫髓鞘模型的療效,并研究HF對髓鞘的保護以及促進髓鞘再生的作用,探討其可能的作用機制。第一部分羥基法舒地爾的細胞毒性及其對SHSY-5Y神經(jīng)元細胞活性、形態(tài)的影響目的:觀察并比較HF及鹽酸法舒地爾的細胞毒性及其對SHSY-5Y神經(jīng)元細胞活性和形態(tài)的影響。方法:SHSY-5Y(人源多巴胺神經(jīng)細胞系)經(jīng)標準程序復蘇后進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。待生長狀態(tài)和細胞密度合適時進行藥物干預實驗,將神經(jīng)元與不同濃度的HF及鹽酸法舒地爾(3μg,15μg,75μg,200μg/ml)共同培養(yǎng)24h。神經(jīng)元的活性采用MTT比色法檢測。對神經(jīng)元的細胞毒性測定采用LDH酶標法。SHSY-5Y神經(jīng)元與HF、鹽酸法舒地爾共培養(yǎng)24h后,在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀態(tài)中的神經(jīng)元的形態(tài)。結果:1.同PBS對照組相比,相對低濃度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及鹽酸法舒地爾的細胞毒性不顯著,隨著藥物濃度的增加,對SHSY-5Y神經(jīng)元的毒性增加,特別是當濃度達到200μg/ml時,與PBS組相比,P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。HF與鹽酸法舒地爾組間無顯著差異。2.同PBS對照組相比,相對低濃度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及鹽酸法舒地爾并不影響細胞活性,但是當濃度增加至75μg/ml,200μg/ml時SHSY-5Y神經(jīng)元活性降低,P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。HF與鹽酸法舒地爾組間無顯著差異。3.相對低濃度(3μg/ml)的HF和鹽酸法舒地爾未明顯影響SHSY-5Y神經(jīng)元的形態(tài),當濃度增至15μg/ml時可有效促進神經(jīng)突的形成,而當濃度增至75μg/ml時可見神經(jīng)突受損。結論:HF在體外實驗中表現(xiàn)出較好的安全性,與鹽酸法舒地爾相比無顯著差異。第二部分羥基法舒地爾對小鼠的急性毒性實驗目的:觀察HF對小鼠的急性毒性,評價藥物的安全性。方法:第一部分:將36只C57BL/6小鼠(8-10周齡,20-22g)隨機分為6組(雌雄各半),即鹽酸法舒地爾-80、100、125mg/kg和HF-80、100、125mg/kg。將HF和鹽酸法舒地爾溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,使用前用0.1%冰醋酸稀釋,腹腔注射。DMSO的最終濃度為10%(v/v)。觀察小鼠的毒性反應,包括皮毛、進食情況、大小便情況、自主運動情況及不自主運動癥狀、死亡情況等。第二部分:為了排除酸性溶劑對實驗結果的影響,重復100mg/kg和125mg/kg兩個濃度組的實驗。將16只C57BL/6小鼠隨機分成4組(雌雄各半),使用0.9%Na Cl溶解鹽酸法舒地爾,HF溶解方法同前。觀察小鼠的毒性反應,包括皮毛、進食情況、大小便情況、自主運動情況及不自主運動癥狀、死亡情況等。結果:1.第一部分實驗結果顯示:隨著藥物濃度的增加,小鼠的自主運動逐漸減少,呼吸頻率增加,雙后肢緊貼地面,無法站立。與HF組相比,相同濃度的鹽酸法舒地爾組小鼠自主運動較少,不自主運動增加,抽搐發(fā)生率和死亡率較高。鹽酸法舒地爾-125mg/kg組小鼠在藥物注射2分鐘后出現(xiàn)驚厥,隨后全身僵硬,然后死亡;相同濃度的HF組小鼠僅表現(xiàn)為自主運動減少,并且沒有出現(xiàn)抽搐和死亡現(xiàn)象。2.第二部分結果顯示:鹽酸法舒地爾-125mg/kg(0.9%Na Cl溶解)組中的兩只小鼠在注射藥物5分鐘后出現(xiàn)驚厥,呼吸速率加快并于30分鐘后死亡。其余兩只小鼠表現(xiàn)出較少的自主運動,雙后肢不能站立。HF-125mg/kg(DMSO+0.1%冰醋酸溶解)組小鼠除了自主活動輕度減少以外,并沒有出現(xiàn)抽搐和死亡現(xiàn)象。結論:HF的最大耐受劑量大于125mg/kg,說明HF較鹽酸法舒地爾毒性更低,安全性更高。第三部分羥基法舒地爾對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的防治作用及機制研究目的:建立髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55誘導的EAE小鼠模型,觀察HF在EAE模型中的治療效果,并探討其可能的分子機制。方法:EAE模型由MOG35-55多肽免疫雌性C57BL/6小鼠制備。隨機分為EAE組、HF治療組。HF于免疫后第3天開始腹腔注射(40mg/kg/d)直至第28天。期間觀察小鼠行為學變化。免疫后第28天,取脊髓制備冰凍切片行組織學檢測:蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、盧卡斯快藍(Luxol Fast Blue,LFB)染色。提取脊髓組織蛋白,通過Western blot法檢測NF-κB、COX-2、i NOS的表達。制備脾單個核細胞(Mononuclear cells,MNCs),應用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群;收集MNCs培養(yǎng)上清液,應用ELISA法檢測細胞因子;應用Real-time PCR法檢測脾MNCs中趨化因子的表達,以及脊髓中M1、M2型巨噬細胞標志物指標。在另一項實驗中,建立EAE模型,于免疫后第9天,取脾臟制備MNCs,應用MOG刺激,與HF共培養(yǎng),檢測脾MNCs培養(yǎng)上清液中炎性細胞因子的濃度。結果:1.行為學變化:免疫后第12天EAE組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)運動功能障礙,平均發(fā)病時間為免疫后(16.38±4.98)天,且隨時間延長,臨床癥狀加重,評分逐漸增高,EAE組小鼠的臨床癥狀的平均最高分值為(3.84±1.09)分,HF治療組小鼠則未出現(xiàn)可測的運動障礙表現(xiàn),兩組之間差異顯著(P0.01,P0.001)。2.組織學檢測:脊髓冰凍切片HE染色顯示:EAE小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)大量炎性細胞密集環(huán)繞于小血管周圍,呈血管“袖套樣”改變。EAE組炎性細胞浸潤面積占白質(zhì)總面積的(1.15±0.09)%,HF治療組為(0.64±0.18)%,炎性細胞的浸潤明顯減少,兩組比較有統(tǒng)計學意義(P0.01)。LFB染色可見EAE小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)片狀髓鞘脫失區(qū)。EAE組髓鞘脫失區(qū)占白質(zhì)總面積的(1.20±0.16)%,HF治療組為(0.37±0.02)%,顯著減少了脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘的脫失(P0.01)。3.流式細胞術檢測HF對EAE小鼠脾MNCs中T淋巴細胞亞群變化的影響。結果顯示,與EAE組相比,HF可上調(diào)CD4+CD25+T細胞的比例(P0.05);下調(diào)CD4+IFN-γ+(P0.05)和CD4+IL-17+T(P0.05)細胞的比例。同時,與EAE組相比,HF可抑制脾MNCs培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-17的表達(P0.05)。4.Real-time PCR檢測巨噬細胞標志物的表達,結果顯示,與EAE組相比,HF增加了M2型巨噬細胞標志物Arg-1(P0.05)、IL-4(P0.01)、TGF-β(P0.01)的表達,并抑制M1型巨噬細胞標志物i NOS(P0.001)、CD68(P0.001)和TNF-α(P0.001)的表達。5.HF抑制了EAE小鼠脊髓內(nèi)p-NF-κB/p65的表達(P0.05),而且降低了COX-2和i NOS的水平(P0.05,P0.05)。6.體外實驗結果顯示:HF降低了脾MNCs培養(yǎng)上清液中炎性細胞因子IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-1β的濃度(P0.05),并抑制了趨化因子MIP-1a(p0.05)、MCP-1(P0.01)、RANTES(P0.01)的表達。結論:1.成功制備MOG35-33誘導的小鼠EAE模型;2.HF可延遲EAE小鼠模型的發(fā)病時間,改善CNS的髓鞘脫失,減輕臨床癥狀的嚴重性;3.HF通過減少脾細胞中趨化因子的表達起到抑制炎性細胞向CNS浸潤的作用;4.HF通過促進T細胞各亞群間的平衡而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;5.HF通過下調(diào)致炎性細胞因子,促進巨噬細胞表型由M1向M2型轉變,并抑制NF-κB的活化,下調(diào)i NOS和COX-2的表達起到緩解神經(jīng)炎性反應的作用。第四部分羥基法舒地爾、鹽酸法舒地爾治療雙環(huán)己酮草酰二腙誘導的脫髓鞘模型的療效比較及作用機制研究目的:比較HF與鹽酸法舒地爾對CPZ誘導的脫髓鞘小鼠模型的治療效果,并探究其作用機制。方法:將雄性C57BL/6小鼠隨機分為四組:正常組:接受常規(guī)飼料喂養(yǎng)6周;CPZ模型組:投喂含0.2%CPZ(w/w)的飼料6周;鹽酸法舒地爾治療組:投喂含0.2%CPZ(w/w)的飼料6周,于造模四周后給予腹腔注射鹽酸法舒地爾(40mg/kg/d);HF治療組:投喂含0.2%CPZ(w/w)的飼料6周,于造模四周后給予腹腔注射HF(40mg/kg/d)。正常組及CPZ模型組于四周后給予腹腔注射等量生理鹽水。于實驗結束時應用高架十字迷宮(EPM)和垂直木實驗來檢測小鼠的焦慮水平和運動能力。應用LFB和黑金染色(Black GoldⅡ,BGⅡ)對腦冰凍切片進行染色,以及Western blot法檢測髓鞘堿性蛋白MBP的表達,免疫熒光染色法檢測MBP的表達以及腦內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量來評估CPZ小鼠腦內(nèi)髓鞘的脫失程度。分離脾臟并稱取重量,制備脾MNCs,一部分MNCs通過流式細胞術檢測T細胞亞群的分布、B細胞的比例;另一部分脾MNCs在含有MOG35-55(10μg/ml)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時。采用ELISA法檢測各組小鼠腦內(nèi)、血清以及脾MNCs培養(yǎng)上清液中細胞因子的濃度。應用ELISA法檢測血清、脾MNCs培養(yǎng)上清液以及腦組織中的抗-MOG抗體,并應用Dot blot法和免疫熒光染色法檢驗其特異性。通過免疫熒光染色法,檢測腦內(nèi)抗-CD4、CD68、B220、Iba-1、i NOS,NF-κB和BDNF的表達。結果:1.與正常組相比,CPZ模型組小鼠表現(xiàn)出明顯的行為學的改變,EPM檢測結果顯示,CPZ模型組小鼠進入閉合臂的次數(shù)明顯增加(正常組為4.75±0.93,CPZ模型組為10.08±1.89,P0.01)。同CPZ模型組相比,鹽酸法舒地爾組(6.58±1.04)及HF組(5.83±0.79)有效地減少了CPZ小鼠進入閉合臂的次數(shù)(P0.05,P0.05),但是鹽酸法舒地爾組及HF組之間無顯著差異。垂直木檢測結果顯示CPZ模型組小鼠自檢測裝置頂端至底部所需時間較正常組明顯增加,正常組為(5.72±0.83)s,CPZ模型組為(15.29±1.24)s,P0.01。與CPZ模型組相比,鹽酸法舒地爾組為(11.71±1.01)s,P0.05,HF組為(10.14±1.10)s,P0.05,有效地改善了CPZ小鼠的運動能力。但是鹽酸法舒地爾組及HF組之間的差異未達到統(tǒng)計學意義。2.同正常組相比,CPZ模型組小鼠腦內(nèi)胼胝體區(qū)LFB光密度、BGⅡ染色密度及MBP的表達均明顯降低(P0.001)。同CPZ模型組相比,HF組及鹽酸法舒地爾組各染色法結果均顯示小鼠腦內(nèi)髓鞘的脫失明顯減輕(P0.01,P0.001)。鹽酸法舒地爾組BGⅡ染色法的光密度值高于HF組,該差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.CPZ模型組小鼠腦蛋白中MBP含量比正常組減少(P0.001)。同CPZ模型組相比,鹽酸法舒地爾組及HF組腦蛋白中MBP的含量明顯增加(P0.001)。鹽酸法舒地爾組MBP的表達高于HF組,差異顯著,具有統(tǒng)計學意義,P0.05。同正常組相比,CPZ模型組O4+少突膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少(正常組為396.61±29.74,CPZ模型組94.23±9.23,P0.001)。鹽酸法舒地爾組(255.80±25.11)及HF組(258.24±26.37)較CPZ模型組相比,可有效增加O4+少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量(P0.001)。鹽酸法舒地爾組及HF組之間無顯著差異。4.CPZ組小鼠的脾臟質(zhì)量較正常組明顯減小,正常組為(113.50±14.92)g,CPZ模型組為(57.13±2.65)g,P0.001。鹽酸法舒地爾組脾臟質(zhì)量為(70.77±5.16)g,HF組為(65.83±3.04)g,同CPZ模型組相比,二者均可部分程度上改善CPZ所誘導的脾臟萎縮(P0.05)。鹽酸法舒地爾組及HF組之間差異不顯著。5.通過ELISA法于CPZ小鼠的血清、脾MNCs培養(yǎng)上清液以及腦蛋白中均檢測到抗-MOG抗體,同正常組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001,P0.01,P0.05),鹽酸法舒地爾及HF可顯著抑制CPZ小鼠血清、脾MNCs培養(yǎng)上清液以及腦蛋白中抗-MOG抗體的濃度(P0.001,P0.01),并且同鹽酸法舒地爾相比,HF對抗-MOG抗體的抑制作用更強,兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。應用Dot blot法檢驗不同稀釋比例的血清中抗-MOG抗體的表達,CPZ模型組顯著高于正常組,P0.001,鹽酸法舒地爾和HF表現(xiàn)出對該抗體的有效抑制,與CPZ模型組相比差異顯著(P0.001,P0.01)。HF較鹽酸法舒地爾的抑制作用更顯著(P0.05)。通過免疫熒光染色法驗證了抗-MOG抗體可特異性地與少突膠質(zhì)細胞結合。應用流式細胞術分析脾MNCs中B淋巴細胞亞群的比例,正常組、CPZ模型組、鹽酸法舒地爾組及HF組分別為:(52.37±0.52)%,(62.17±0.13)%,(54.87±0.59)%,(52.97±0.23)%,與正常組相比,CPZ模型組的B220+B細胞比例增加(P0.001)。而與CPZ模型組相比,鹽酸法舒地爾及HF可抑制這一改變(P0.001),并且HF組同鹽酸法舒地爾組相比,該比例更低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.在CPZ模型小鼠腦內(nèi),可觀察到CD4、CD68以及B220陽性的T淋巴細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞的表達,同正常組相比,差異顯著(P0.001)。鹽酸法舒地爾及HF可顯著抑制上述細胞向CPZ小鼠腦內(nèi)的浸潤(P0.001)。7.同正常組相比,CPZ模型小鼠腦內(nèi)胼胝體區(qū)以及紋狀體區(qū)可見Iba-1+小膠質(zhì)細胞的數(shù)量的顯著增加(P0.001);與CPZ模型組相比,鹽酸法舒地爾及HF可有效地減少CPZ小鼠腦內(nèi)該細胞的數(shù)量(P0.001);鹽酸法舒地爾組及HF組之間無顯著差異。應用雙染技術,可見CPZ模型組小鼠腦內(nèi)Iba-1+i NOS+以及Iba-1+NF-κB+的細胞數(shù)量較正常組明顯增加(P0.001),鹽酸法舒地爾及HF可有效地減少CPZ小鼠腦內(nèi)上述炎性細胞的數(shù)量,同CPZ模型組相比,差異顯著,P0.001,而鹽酸法舒地爾及HF組之間無顯著差異。鹽酸法舒地爾及HF尚可抑制腦內(nèi)炎性細胞因子IL-4(P0.001)、IL-1β(P0.001)和TNF-α的水平。8.HF促進了星形膠質(zhì)細胞來源的BDNF的產(chǎn)生。結論:1.HF及鹽酸法舒地爾可通過抑制抗-MOG特異性抗體的產(chǎn)生,抑制小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥、抑制外周炎性細胞浸潤進而改善炎性微環(huán)境等作用來發(fā)揮對CPZ模型髓鞘的保護作用。2.HF還可促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生來促進髓鞘的再生。此外,同鹽酸法舒地爾相比,HF表現(xiàn)出更強的抑制抗-MOG抗體的作用。結論1.HF的細胞毒性及其對細胞活性、細胞形態(tài)的影響呈濃度依賴型表現(xiàn)。2.HF的最大耐受劑量高于鹽酸法舒地爾,具有較好的安全性。3.HF可改善EAE模型的臨床癥狀,減輕脊髓中炎性細胞浸潤,改善髓鞘脫失,并通過調(diào)節(jié)免疫、抑制神經(jīng)炎性反應等途徑發(fā)揮作用。4.HF及鹽酸法舒地爾可通過抑制抗-MOG特異性抗體的產(chǎn)生,抑制小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥、改善炎性微環(huán)境,促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生等作用來發(fā)揮對CPZ模型的髓鞘保護以及促進髓鞘再生的作用。5.HF作為鹽酸法舒地爾在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物,二者在治療CPZ模型中療效相近,但是同鹽酸法舒地爾相比,HF具有對抗-MOG特異性抗體的抑制作用更強、毒性更低、不良反應更低的優(yōu)勢,具有很大的潛在應用價值。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R744.5;R-332
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學博士學位論文2 結 果 不同濃度 HF 和鹽酸法舒地爾對 SHSY-5Y 神經(jīng)元的細胞毒性檢測如圖 1-1 所示，同 PBS 對照組相比，相對低濃度（3μg/ml，15μg/ml）的 H法舒地爾細胞毒性不顯著，隨著藥物濃度的增加，二者均可濃度依賴Y-5Y 神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，特別是當濃度達到 200μg/ml 時，對 SHSY-5Y 神經(jīng)顯著，與 PBS 組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。HF 與鹽酸法舒地 SHSY-5Y 神經(jīng)元的細胞毒性無顯著差異。

圖 1-2 HF 和鹽酸法舒地爾對 SHSY-5Y 神經(jīng)元細胞活性的影響（*P＜0.05）3 不同濃度 HF 和鹽酸法舒地爾對 SHSY-5Y 神經(jīng)元形態(tài)的影響如圖 1-3 所示，同 PBS 對照組相比，相對低濃度（3μg/ml）的 HF 和鹽酸法舒爾未明顯影響 SHSY-5Y 神經(jīng)元的形態(tài)，當濃度增至 15μg/ml 時可有效促進SY-5Y 神經(jīng)元的神經(jīng)突的形成，而當濃度增至 75μg/ml 時可見神經(jīng)突受損。

圖 1-2 HF 和鹽酸法舒地爾對 SHSY-5Y 神經(jīng)元細胞活性的影響（*P＜同濃度 HF 和鹽酸法舒地爾對 SHSY-5Y 神經(jīng)元形態(tài)的影響 1-3 所示，同 PBS 對照組相比，相對低濃度（3μg/ml）的 HF 和明顯影響 SHSY-5Y 神經(jīng)元的形態(tài)，當濃度增至 15μg/ml 時可Y 神經(jīng)元的神經(jīng)突的形成，而當濃度增至 75μg/ml 時可見神經(jīng)突受
【參考文獻】

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1 張海飛;郭敏芳;孟健;劉春云;李艷花;尉杰忠;侯紹蔚;豐玲;肖保國;馬存根;;法舒地爾對LPS刺激小膠質(zhì)細胞表型演變的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2012年08期

本文編號：2853834