第一部分外源性一氧化氮對大鼠慢性胃潰瘍的保護作用目的:迷走神經(jīng)在胃腸道炎癥發(fā)生時通過膽堿能抗炎癥反射(Cholinergic anti-inflammation reflex,CAIF),又稱炎癥反射(Inflammation Reflex)調(diào)節(jié)和控制免疫反應,抑制炎癥水平,但在胃腸道發(fā)生炎癥時局部迷走神經(jīng)末梢被激活的傳入通路尚不清楚。多項研究表明NO在胃潰瘍的發(fā)生中發(fā)揮保護作用,但機制尚不明確。有研究提示一氧化氮能夠間接激活消化道迷走神經(jīng)末梢,然而尚沒有直接證據(jù)表明其參與膽堿能抗炎反射。本研究的目的是證實外源性一氧化氮對胃潰瘍的保護作用是直接激活迷走神經(jīng),同時探索其可能的機制。方法:通過胃壁漿膜下注射冰醋酸的方法誘導大鼠慢性胃潰瘍模型。通過腹膜腔注射NO外源性供體硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP),或者預先膈下迷走神經(jīng)切除術后腹膜腔注射SNP,或者聯(lián)合注射SNP及TRPV1通道阻斷劑(capsazepine,CZP)干預潰瘍的形成。術后第四天處死動物通過測量潰瘍面積、組織切片HE染色、組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性檢測等方法評估炎癥水平。結果:1. SNP對潰瘍面積、宏觀形態(tài)的影響腹膜腔注射SNP對胃黏膜組織的充血、水腫及潰瘍形成有明顯改善作用,潰瘍面積明顯減小,由1. 16 ± 0. 12 mm2減小到0. 74 ± 0. 12 mm2 (P 0. 05,n = 6),同時注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術后,SNP的作用消失。2. SNP對胃組織組織學表現(xiàn)的影響冰醋酸對照組可見胃黏膜下層結構破壞,出血及滲出,炎性細胞浸潤。腹膜腔注射SNP后炎癥表現(xiàn)明顯減輕,同時注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術后,SNP的作用消失。3. SNP對胃組織內(nèi)MPO活性的影響冰醋酸對照組大鼠胃組織的MPO活性比生理鹽水對照組明顯增高(1.79± 0. 37 U/g vs 0.23 ± 0.05 U/g,P 0. 05,n = 6)。經(jīng) SNP 連續(xù)腹膜腔注射4天后,胃的MPO活性顯著降低(P0.05,n = 6)。同時注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術后,SNP的作用消失。結論:外源性NO對冰醋酸誘導的大鼠慢性胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展起到保護作用,這種作用是通過迷走神經(jīng)實現(xiàn)的,提示NO可能參與迷走神經(jīng)抗炎反射的傳入通路,并且TRPV1通道可能參與這個過程。第二部分外源性一氧化氮對大鼠腸系膜傳入神經(jīng)放電的影響及其機制目的:研究發(fā)現(xiàn),NO主要有以下兩種信號途徑:經(jīng)典的環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-PKG通路,以及不依賴于cGMP的亞硝基化(S-nitrosylation)途徑。目前,亞硝基化被認為是一種與磷酸化相似的新的信號轉導調(diào)控機制。通過亞硝基化,NO可以調(diào)控多種離子通道的活性。研究證實一氧化氮能夠間接激活消化道迷走神經(jīng)末梢,然而尚沒有證據(jù)表明其可以通過直接的硝基化作用激活腸系膜傳入神經(jīng)。作為硝基化修飾的靶點之一,TRPV1在消化道迷走神經(jīng)傳入末梢也有豐富表達。有研究表明TRPV1在炎癥中也發(fā)揮重要作用。本研究的目的是探索外源性一氧化氮對腸系膜傳入神經(jīng)放電的直接作用及其機制,以期揭示NO在傳入神經(jīng)水平的抗炎作用機制。方法:利用離體腸系膜傳入神經(jīng)電活動記錄分析技術記錄SNP對離體雄性大鼠、小鼠和TRPV1--小鼠空腸傳入神經(jīng)生物電活動的影響,并用單信號分析(Single Unit Analysis)方法分析其對不同類型神經(jīng)纖維的作用。并分別用膈下迷走神經(jīng)切斷術、巰基保護劑N-ethylmaleimide (NEM)、選擇性GC阻斷劑1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-l-one (ODQ)、TRPV1 阻斷劑 CZP研究SNP的作用機制。結果:1. NO供體SNP對大鼠腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的影響待神經(jīng)放電穩(wěn)定后,向腸段漿膜面加入4 mM的SNP, 2 min內(nèi)腸系膜傳入神經(jīng)放電頻率明顯增加,放電頻率差值從1.3 ± 1.2 imp/s增加到48. 5 ±7.3 imp/s (P0.05,n = 6),而低濃度(0.01 mM )的SNP對自發(fā)放電并沒有顯著作用(P 0.05,n = 6),SNP的作用表現(xiàn)出濃度依賴性,半數(shù)有效率 ED50為 0. 16 mM。2. NO供體SNP對傳入神經(jīng)中不同神經(jīng)成分的自發(fā)放電的影響用單信號分析(single-unit analysis)的方法,分析到59個機械敏感性傳入神經(jīng)放電信號。其中17個信號發(fā)自低閾值神經(jīng)纖維,一般認為這類纖維為迷走傳入纖維;20個信號發(fā)自高閾值神經(jīng)纖維,一般認為這類纖維為脊神經(jīng)中的內(nèi)臟痛覺傳入纖維;其余22個信號發(fā)自寬閾值神經(jīng)纖維。SNP增加了低閾值神經(jīng)纖維的自發(fā)放電水平(P 0.05),但對高閾值的纖維成分沒有影響。3.膈下迷走神經(jīng)切斷術對SNP作用的影響大鼠在麻醉狀態(tài)下行膈下迷走神經(jīng)切斷術,14天后犧牲動物,取出空腸,用含0.16 mM SNP的柯氏液預孵育后,迷走神經(jīng)切斷手術組的大鼠傳入神經(jīng)放電頻率增加值降低到2. 6 ± 0. 4 imp/s,明顯低于假手術組(26. 9 ± 5. 2 imp/s,P 0.01, n = 6) 。4.巰基保護劑及選擇性GC阻斷劑對SNP作用的影響在器官浴槽中加入NEM (5 mM)預孵育15 min后,SNP不再引起腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的增加,NEM組加入SNP后放電頻率增加值比DMSO組明顯降低,從 23. 4 ± 5. 2 imp/s 降至 0. 2 ± 5. 7 imp/s (P0. 05,n = 6);然而ODQ(10 μM)預孵育10min并不影響SNP的作用(P=0.52,n = 6)。5. TRPV1通道阻斷劑、基因敲除對SNP作用的影響及SNP對辣椒素敏感性的影響空腸標本用含CZP (50 μM)的柯氏液預孵育10 min后,SNP誘發(fā)放電增加較DMSO對照組明顯降低,從25. 8 ± 5. 6 imp/s降至8. 4 ± 4. 1 imp/s(P 0.05,n=6)。SNP和辣椒素具有明顯的協(xié)同作用,兩者共同作用所引起的傳入神經(jīng)放電頻率增加值從8.2 ± 1.8 imp/s (辣椒素的單獨作用)增加至 20.9 ± 2.7 imp/s (P 0. 05,n = 6)。SNP 對 TRPV1 基因敲除小鼠腸系膜傳入神經(jīng)放電的作用遠低于野性型小鼠(P0.001, n = 6)。結論:SNP通過激活大鼠空腸腸系膜傳入神經(jīng)中的迷走神經(jīng)纖維末梢,上調(diào)其自發(fā)放電的頻率,該作用主要是通過巰基亞硝基化作用實現(xiàn)的,TRPV1通道參與了這一過程。第三部分外源性一氧化氮對大鼠結狀神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電活動的影響及其機制目的:前期實驗證實SNP通過巰基亞硝基化作用激活腸系膜迷走神經(jīng)傳入纖維,且在這個過程中有TRPV1通道的參與。為了進一步證實SNP對迷走神經(jīng)的選擇性激活作用,并驗證TRPV1是巰基亞硝基化的靶點,我們在神經(jīng)元水平進行電生理實驗,進一步研究SNP的作用及其機制。方法:分離大鼠結狀神經(jīng)節(jié)(nodose ganglion,NG)、T7 - L5節(jié)段的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG),消化分離出單個神經(jīng)元細胞后接種于玻片上。利用全細胞膜片鉗記錄神經(jīng)元細胞靜息膜電位、辣椒素(capsaicin,CAP)激發(fā)膜電流,電信號通過Axon膜片鉗放大器和A/D轉換器記錄入計算機,使用Clampex10. 2軟件進行信號采集和分析。結果:1. NO供體SNP對NG神經(jīng)元細胞靜息膜電位的影響NG 細胞的靜息膜電位為-57.4 ± 1.3 mV (n = 43)。SNP (0.16 mM)使NG細胞膜發(fā)生明顯去級化(P 0.05,n = 7),經(jīng)細胞外液沖洗可部分恢復,低濃度的SNP (0.016 mM)不影響NG神經(jīng)元的膜電位。2.巰基保護劑及選擇性GC阻斷劑對SNP作用的影響用含巰基保護劑NEM (5mM)的細胞外液孵育NG細胞15min后,SNP引起膜去極化的作用明顯減低(P0.01, n= 7)。然而選擇性GC阻斷劑ODQ(10 μM)預孵育10 min并不影響SNP的作用。3. TRPV1通道阻斷劑對SNP作用的影響用TRPV1阻斷劑CZP (50 μM)孵育NG細胞10 min后,SNP引起膜去極化的作用明顯減低(P 0.05,n = 7)。4. SNP對NG神經(jīng)元細胞辣椒素電流的影響SNP (0.16 mM)顯著增加NG細胞中辣椒素誘發(fā)的內(nèi)向電流(capsaicin-induced inward current,Icap)的幅度,電流峰值從-609. 4 ± 88.0 pA 增加至-1224.3 ± 202. 1 pA (P 0.05, n = 7)。NEM (5 mM)孵育顯著降低SNP的作用,而ODQ (10 μM)對其沒有明顯影響。5. SNP對DRG神經(jīng)元細胞靜息膜電位的影響SNP (0.0016 - 0. 16 mM)使DRG細胞膜電位發(fā)生超級化(P 0.05,n = 7),經(jīng)細胞外液沖洗可恢復至靜息膜電位水平,呈現(xiàn)濃度依賴性。結論:SNP能夠通過巰基亞硝基化作用激活NG神經(jīng)元上的TRPV1通道,并提高神經(jīng)元細胞對辣椒素的化學敏感性,提示TRPV1是亞硝基化的直接靶點。SNP對DRG的作用與之相反,證實了 SNP對迷走神經(jīng)傳入纖維的激活作用具有特異性。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R573.1;R-332
【部分圖文】：

圖１?ＳＮＰ對胃潰瘍宏觀形態(tài)的影響。??ｉ為生理鹽水對照組，ｉｉ為冰醋酸對照組，ｉｉｉ為冰醋酸＋ＳＮＰ?（３ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，??ｂｉｄ）組，ｉｖ?為冰醋酸?＋ＣＺＰ?（１．２ｍｇ／ｋｇ，?Ｌｐ．，ｂｉｄ）組，ｖ?為冰醋酸?＋ＣＺＰ?＋??ＳＮＰ組，ｖｉ為迷走神經(jīng)切斷＋冰醋酸組，ｖｉｉ為迷走神經(jīng)切斷＋冰醋酸＋?ＳＮＰ??組。除生理鹽水對照組的胃黏膜完整光滑、無潰瘍，其他六組動物的胃黏膜均有??不同程度的充血、水腫及潰瘍形成。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｔｈｅ?ｇｒｏｓｓ?ａｐｐｅａｒａｎｃｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｍｕｃｏｓａ?ｉｎ?ｒａｔｓ??ｔｒｅａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ａｃｅｔｉｃ?ａｃｉｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｗａｌｌ?ｏｆ?ｓｔｏｍａｃｈ?ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｗｉｔｈ?ｎｏｒｍａｌ?ｔｉｓｓｕｅ?ｏｆ??ＮＳ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ．??Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓｉｚｅｓ?ｏｆ?ｕｌｃｅｒ?ａｒｅ?ｓｅｅｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｉｘ?ａｃｉｄ－ｔｒｅａｔｅｄ?ｇｒｏｕｐｓ?ｅｘｃｅｐｔ?ｔｈｅ?ＮＳ?ｃｏｎｔｒｏｌ，?（ｉ）??ＮＳ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（ｉｉ）?ｕｌｃｅｒ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（ｉｉｉ）?ＳＮＰ?（３ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，?ｂｉｄ）?ｇｒｏｕｐ；?（ｉｖ）??

１?２?３?４?５?６?７??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｕｌｃｅｒ?ＳＮＰ?ＣＺＰ?ＣＺＰ＋ＳＮＰ?Ｖａｇｏｔｏｍｙ?Ｖａｇｏｔｏｍｙ＋ＳＮＰ??圖２?ＳＮＰ對胃潰瘍面積的影響。??冰醋酸對照組大鼠的胃潰瘍面積比生理鹽水對照組明顯增高；冰醋酸的潰瘍面積比冰醋酸對照組顯著降低。ＣＺＰ沒有改變潰瘍的面積，但的作用。預先迷走神經(jīng)切斷的大鼠，冰醋酸處理組表現(xiàn)為潰瘍面積的注射ＳＮＰ并沒有降低潰瘍的面積，＊?Ｐ?＜?０．?０５?ｗ生理鹽水對照組，ｖｓ冰醋酸對照組，迷走祌經(jīng)切斷＋冰醋酸組樣本量《＝?１０，其余六Ｆｉｇｕｒｅ?２?Ｓｕｍｍａｒｙ?ｖａｌｕｅｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｔｈｅ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｕｌｃｅｒ?ａｒｅａ?（ＵＡ）?ｉｎ?ｔｇｒｏｕｐｓ．??ＳＮＰ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ?ｄｅｃｒｅａｓｅｄ?ＵＡ．?ＴＲＰＶ１?ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ?ｄｉｄｎ’ｔ?ｐｒｏｄｕｃｅ?ｈｉｇｈｅｒｒｅｄｕｃｅｄ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＳＮＰ．?Ｐｒｉｏｒ?ｓｕｂｄｉａｐｈｒａｇｍａｔｉｃ?ｖａｇｏｔｏｍｙ?ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．＝

圖３?ＳＮＰ對胃組織形態(tài)學表現(xiàn)的影響。??ｉ為生理鹽水對照組；ｉｉ為冰醋酸對照組，冰醋酸誘導的大鼠慢性胃潰瘍主要表??現(xiàn)為粘膜腺體消失、出血及中性粒細胞浸潤、壞死和再生；ｉｉｉ為冰醋酸＋?ＳＮＰ??（３ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，?ｂｉｄ）組，ＳＮＰ減輕了炎癥細胞浸潤的程度；ｉｖ為冰醋酸＋ＣＺＰ??（１．２?ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，ｂｉｄ）組，ｖ為冰醋酸＋?ＣＺＰ?＋?ＳＮＰ組，ｖｉ為迷走神經(jīng)??切斷＋冰醋酸組，ｖｉｉ為迷走神經(jīng)切斷＋冰醋酸＋?ＳＮＰ組，同時注射ＣＺＰ、??預先迷走神經(jīng)切斷均可阻斷ＳＮＰ的作用。??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ?ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｍｕｃｏｓａ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｅｖｅｎ?ｇｒｏｕｐｓ．??Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＳＮＰ?ｗａｓ?ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ?ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ．?Ａｃｅｔｉｃ?ａｃｉｄ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｅｖｅｒｅ??ｄａｍａｇｅ?ｏｆ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｍｕｃｏｓａ，?ｗｈｉｃｈ?ｗａｓ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ?ｂｙ?ｓｕｂｍｕｃｏｓａ?ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，??ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ?ｉｎｊｕｒｙ?ａｎｄ?ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ?ｃｅｌｌ?ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．?Ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｕｌｃｅｒ??
【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;某些因素對大鼠胃肌電的影響[J];基礎醫(yī)學與臨床;2001年S1期

2 陳同度,張昌穎;素食大鼠的貧血現(xiàn)象[J];營養(yǎng)學報;1957年04期

3 陳偉強;趙善廣;;自制注射用大鼠固定裝置[J];上海實驗動物科學;1992年04期

4 肖柳英,林培英,馮昭明,張丹;不同周齡的SD大鼠生理、生化及體重的正常值測定[J];中藥新藥與臨床藥理;1996年03期

5 李淑云;簡易大鼠灌胃器的制作[J];錦州醫(yī)學院學報;2001年04期

6 楊明智,陳積圣;一種大鼠抓取與固定的新工具介紹[J];上海實驗動物科學;2001年03期

7 戴英,陸群;復方H_(505)對Wistar大鼠外周血的血液流變學指標的影響[J];中國血液流變學雜志;2001年01期

8 韋應波,孫喜慶,曹新生,姚永杰,馮岱雅,楊長斌;+Gz暴露時間對大鼠記憶功能和行為的影響[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2003年01期

9 呂學軍,郭俊生,李敏,周利梅,張永娟;暈船大鼠體內(nèi)鐵含量的變化[J];中國職業(yè)醫(yī)學;2003年04期

10 湯仁仙,王迎偉,王慧,周峰;201A中藥合劑對大鼠抗腎小球基底膜腎炎病變的影響[J];徐州醫(yī)學院學報;2003年06期

相關博士學位論文 前10條

1 韓婷;外源性一氧化氮對大鼠慢性胃潰瘍的保護作用及其機制[D];山東大學;2017年

2 楊靜;消癌解毒方干預W256移植瘤大鼠生存及血、尿代謝的研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

3 韓梅;大鼠前扣帶皮層SIP30參與痛厭惡情緒反應的細胞分子機制[D];復旦大學;2011年

4 李麗紅;卵巢雌激素剝奪對成年大鼠傷害性反應的影響及其機制探討[D];復旦大學;2011年

5 李志遠;瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠左心房交感神經(jīng)重構的影響[D];山東大學;2015年

6 張文強;IL-13對大鼠佐劑性關節(jié)炎的作用及相關機制研究[D];山東大學;2015年

7 宋勇峰;促甲狀腺激素調(diào)節(jié)肝臟膽固醇轉化的機制研究[D];山東大學;2015年

8 沈夏鋒;早期運動訓練對大鼠重度顱腦外傷后腦功能的作用及其機制研究[D];復旦大學;2013年

9 韓海峰;十二指腸空腸旁路術對T2DM大鼠肝臟脂肪沉積的影響和機制研究[D];山東大學;2015年

10 黃新忠;Sirt1對5/6腎切除大鼠的保護作用及相關機制探討[D];復旦大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 李變芳;鈣對鉛致大鼠腦組織損傷的營養(yǎng)干預機制研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 孟靜;鈣對染鉛大鼠骨骼損傷干預機制的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 鄭東;姜黃素對糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的作用研究[D];湖北科技學院;2015年

4 張敏麗;山楂葉總黃酮對大鼠糖尿病心肌病的保護作用及機制研究[D];湖北科技學院;2015年

5 董婷;甘草甜素對大鼠HAART藥物心肌損傷的保護效應與機制[D];福建醫(yī)科大學;2015年

6 張迪;不同途徑移植人臍帶間充質(zhì)干細胞治療糖尿病大鼠的實驗研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2013年

7 劉波;靶向超聲造影對GK大鼠腎臟血流灌注的實驗研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2013年

8 王璐;α7nACh受體在孕期煙熏抑制新生大鼠RRDA中的作用[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2014年

9 文實;基于核磁共振的SD大鼠誘導的胰腺癌及上皮內(nèi)瘤變組織水溶性萃取物代謝組學研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

10 袁鑫;二甲雙胍對鏈脲佐菌素所致大鼠認知功能障礙的作用研究[D];湖北科技學院;2015年

本文編號：2838232