第一部分先天性巨結(jié)腸模型小鼠(Ednrb敲除小鼠)腸道P物質(zhì)及NK細胞的變化在先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎發(fā)病中的作用目的:使用Ednrb敲除小鼠作為先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease,HD)模型小鼠,研究在未發(fā)生及發(fā)生先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung disease associated enterocolitis,HAEC)時腸管擴張段及狹窄段P物質(zhì)(Substance P,SP)及NK細胞的變化,并探究SP及NK細胞相互作用在HAEC發(fā)病中的機制。方法:從美國Jackson實驗室購買Ednrb敲除小鼠,分為HD組和野生型對照組,并按小鼠年齡分為1周(week,w)、2w及3w組,3w組HD小鼠發(fā)生HAEC。HE染色對腸管炎癥程度進行評估,轉(zhuǎn)錄組測序分析各組腸管的基因表達差異,免疫組化和熒光染色分析擴張段及狹窄段腸管SP及NK細胞表達情況,RT-q PCR和Western blot分別在m RNA和蛋白水平分析SP和NK細胞相互作用過程相關(guān)的SP、Nkp46、RORgammat、NK1R、IFNgamma、穿孔素、顆粒酶B及IL22的表達,代謝組學(xué)研究結(jié)腸內(nèi)糞便的代謝化合物變化并關(guān)聯(lián)分析與腸組織基因表達之間的關(guān)系。結(jié)果:3w組HD小鼠發(fā)生HAEC,且擴張段炎癥表現(xiàn)嚴重,狹窄段輕微;轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)3w HD小鼠擴張段的基因表達變化最為明顯,主要為免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)相關(guān)基因,狹窄段基因表達變化并不如此明顯,但SP在3w HD小鼠的狹窄段中明顯上升。免疫組化和熒光染色顯示3w小鼠狹窄段SP表達升高,NK細胞及其亞群NK-22細胞增加,SP、Nkp46、RORgammat、NK1R、IFNgamma及IL22的表達在3w HD小鼠狹窄段上升。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)淀粉及蔗糖代謝途徑和戊糖及葡糖糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑在發(fā)生HAEC小鼠中出現(xiàn)明顯改變并與多種神經(jīng)相關(guān)基因明顯相關(guān)。結(jié)論:HD小鼠發(fā)生HAEC時,擴張段炎癥嚴重而狹窄段較輕,而狹窄段是腸神經(jīng)系統(tǒng)異常的部位,狹窄段的SP、NK細胞、SP在免疫細胞上的受體NK1R、及NK細胞分泌相關(guān)因子表達增加,說明SP與NK細胞之間的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)可能在HAEC發(fā)生時起到維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用。第二部分HD患兒腸道SP及NK細胞的變化在HAEC發(fā)病中的作用目的:收集HD患兒腸道標本,對人類HD腸管擴張段和狹窄段SP的表達及NK細胞的分布情況進行研究,探究SP與NK細胞在HAEC發(fā)病中的作用。方法:收集HD患兒的腸道標本,按照有無HAEC進行分組,并取無腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常的先天性肛管直腸畸形患兒的腸管作對照組,行HE染色評估腸道炎癥,通過免疫組化及熒光的方法觀察SP及NK細胞在各段腸管的表達情況,利用RT-q PCR及Western blot從m RNA及蛋白水平分析SP及NK細胞相互作用過程中的SP、CD16、NK1R、IFNgamma、穿孔素、顆粒酶B及IL22表達情況。結(jié)果:在發(fā)生HAEC的患兒腸道狹窄段炎癥表現(xiàn)弱于擴張段,免疫組化及熒光染色發(fā)現(xiàn)其狹窄段表達較多的SP及分布更多的NK細胞,在未發(fā)生HAEC的HD患兒組的結(jié)果中,SP、CD16、NK1R、IFNgamma、顆粒酶B、穿孔素及IL22在對照組、實驗組擴張段及狹窄段中的m RNA及蛋白表達水平相似,均未見明顯差異。在發(fā)生HAEC患兒組的結(jié)果中,SP、CD16、NK1R、IFNgamma及IL22的m RNA及蛋白表達水平在HAEC組狹窄段的表達水平高于擴張段及對照組;顆粒酶B的m RNA及蛋白表達水平在擴張段的表達高于狹窄段,但與對照組未見明顯差異;穿孔素的m RNA及蛋白表達水平在擴張段的表達水平高于狹窄段和對照組。結(jié)論:HD患兒發(fā)生腸炎時,擴張段炎癥重于狹窄段,狹窄段的SP、NK細胞及相關(guān)因子表達增加,說明SP與NK細胞之間的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)可能在患兒發(fā)生HAEC發(fā)生時起到維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用。第三部分體外實驗研究SP與NK細胞的相互作用及機制目的:分選小鼠結(jié)腸的NK細胞和培養(yǎng)人NK細胞系NK92MI細胞,分別加SP刺激培養(yǎng)后,觀察NK細胞的功能變化并對其中機制進行探討。方法:磁珠分選純化小鼠結(jié)腸NK細胞。分為對照組、梯度濃度SP刺激組及NK1R拮抗劑Aprepitant+梯度濃度SP刺激組,LDH釋放法檢測NK細胞殺傷活性;ELISA檢測培養(yǎng)上清中IFNgamma的濃度,免疫熒光觀察NK細胞IFNgamma及IL22表達。NK92MI細胞系按同樣條件分組,并檢測NK92MI細胞殺傷活性及培養(yǎng)上清中IFNgamma的濃度,將SP刺激后的NK細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析其中可能作用機制,利用Caco2細胞構(gòu)建腸上皮屏障模型,免疫熒光及Western blot觀察SP刺激后的NK細胞對緊密連接蛋白ZO-1的影響。結(jié)果:本實驗所采用方法提取NK細胞的純度為93.50%。SP可增強小鼠Nkp46(+)NK細胞的殺傷活性并促進其分泌IFNgamma和IL-22的作用,且與濃度相關(guān),最佳濃度為10-8M,Aprepitant可阻斷此作用;SP可增強NK92MI細胞系的殺傷活性及促進其分泌IFNgamma,最佳濃度為10-10M,轉(zhuǎn)錄組測序顯示MAPK信號其中作用。加入SP處理的NK92MI細胞組中Caco2細胞的ZO-1表達水平下降最明顯。結(jié)論:SP可增強NK細胞的活性并促進其分泌作用,通過受體NK1R起作用,相關(guān)通路可能為MAPK信號通路,僅具有殺傷功能的NK92MI細胞系對腸上皮具有破壞作用,而提取的Nkp46(+)小鼠原代NK細胞,由于包括NK-22細胞群,其分泌的IL22對腸上皮具有修復(fù)和保護作用,二者的相互平衡使腸道對病原具有更強殺傷抑制作用同時可保護腸上皮完整性維護腸道穩(wěn)態(tài)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R726.5;R-332
【部分圖文】：

巨結(jié)腸模型小鼠基因型鑒定 出現(xiàn) 244bp 和 44僅在 444bp 出現(xiàn)一條條帶的基因型為 Ednrb+/+下圖左側(cè)所示，與 Ednrb+/-表型相同，Ednrb-/

圖 1-2 1w、2w 及 3w 小鼠結(jié)腸標本 HE 染色情況 1w 和 2w 先天性巨結(jié)腸小鼠與對照組相比實驗組結(jié)腸近端和遠端無明顯炎癥表現(xiàn)，粘膜結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細胞浸潤，3w 先天性巨結(jié)腸小鼠在擴張段（近端）結(jié)腸的粘膜層，出現(xiàn)了隱窩膿腫，且在粘膜層和粘膜下層可見較多中性粒細胞浸潤，狹窄段（遠端）結(jié)腸未見明顯炎癥表現(xiàn)。（HD，先天性巨結(jié)腸）

標本的基因表達水平顯示了樣本基因表達的分布情況及樣品中基因豐度隨表達量變化的趨勢，對所測樣本的基因表達量進行了整體描述

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4 程思e

本文編號：2829704