本文關(guān)鍵詞：牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及其檢測試劑盒研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的制備抗牛血紅蛋白(bHb)單克隆抗體雜交瘤細胞株,鑒定抗b Hb單克隆抗體(McAb)。建立雙抗體夾心ELISA檢測方法,以檢測疫苗生產(chǎn)中小牛血清輔料中bHb的含量。方法以新鮮牛全血為原料,提取和純化牛血紅蛋白(bHb),以其作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細胞融合方法,篩選、克隆雜交瘤細胞株,制備抗bHb單克隆抗體;間接ELISA法檢測McAb,免疫印跡鑒定McAb的特異性;用ProteinA親和層析柱純化單克隆抗體腹水中的抗bHb單克隆抗體,過碘酸鈉法對抗體進行辣根過氧化酶標記。用不同株單抗分別作為包被相和檢測相抗體組裝試劑盒;優(yōu)化包被抗體的包被濃度、時間及酶標抗體的工作濃度和時間;組裝成定量檢測bHb含量的雙抗體夾心ELISA試劑盒,對試劑盒的穩(wěn)定性、精密度和特異性及實際應(yīng)用做了系統(tǒng)評價。結(jié)果用層析法提取出具有免疫活性的牛血紅蛋白;經(jīng)雜交瘤篩選技術(shù),獲得4株分泌特異性抗bHb單克隆抗體的雜交瘤:1A10,2A6,3F8和4C6,經(jīng)過長期傳代和反復(fù)凍融,細胞株仍能穩(wěn)定表達特異性抗體。4株McAb腹水ELISA效價能達到1:106~1:108;4株單克隆抗體亞型為IgG1和IgG2a;相對親和力3F84C61A102A6;表位鑒定結(jié)果顯示4株McAb針對3個不同的抗原表位;以1A10和4C6作為包被抗體,3F8作為酶標記抗體,建立雙抗體夾心ELISA方法,組裝的試劑盒具有良好的穩(wěn)定性、特異性和精密度,通過對疫苗生產(chǎn)中小牛血清輔料的檢測,證明該ELISA試劑盒可以應(yīng)用于小牛血清中牛血紅蛋白含量的檢測。結(jié)論成功提取純化了牛血紅蛋白抗原,通過單抗雜交瘤技術(shù),制備出4株抗牛血紅蛋白單克隆抗體,建立了穩(wěn)定性好,特異性強的雙抗體夾心ELISA方法,可以用于疫苗生產(chǎn)中血清輔料中牛血紅蛋白含量的檢測。
【關(guān)鍵詞】：血清輔料 牛血紅蛋白 單克隆抗體 ELISA
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 前言10-15
• 1.1 血紅蛋白概述10-11
• 1.2 血紅蛋白代謝及應(yīng)用11-12
• 1.3. 單克隆抗體技術(shù)12-13
• 1.4 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)13
• 1.5 本課題的研究意義13-15
• 第2章 實驗內(nèi)容15-42
• 實驗一 牛血紅蛋白的提取和純化15-17
• 1.1 材料和方法15-16
• 1.1.1 實驗試劑15
• 1.1.2 牛血紅蛋白的提取和純化15-16
• 1.1.3 提取牛血紅蛋白純度鑒定16
• 1.2 結(jié)果16-17
• 1.2.1 牛血紅蛋白提取方法的確定16
• 1.2.2 提取牛血紅蛋白的鑒定16-17
• 實驗二 牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及鑒定17-28
• 2.1. 材料17-18
• 2.1.1 實驗動物和細胞17
• 2.1.2 主要試劑17
• 2.1.3 主要設(shè)備17-18
• 2.1.4 培養(yǎng)基18
• 2.2 方法18-23
• 2.2.1 動物的選擇18
• 2.2.2 動物免疫18
• 2.2.3 骨髓瘤細胞的準備18-19
• 2.2.4 飼養(yǎng)細胞的制備19
• 2.2.5 免疫脾細胞懸液的制備19
• 2.2.6 細胞融合的步驟19-20
• 2.2.7 陽性孔的篩選20
• 2.2.8 有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞的克隆化20
• 2.2.9 雜交瘤細胞株穩(wěn)定性的分析20-21
• 2.2.10 腹水制備21
• 2.2.11 腹水及細胞培養(yǎng)上清效價的測定21
• 2.2.12 單克隆抗體的亞型分析21
• 2.2.13 Protein A-Sepharose CL-4B親合層析純化單克隆抗體21
• 2.2.14 單克隆抗體的相對親和力測定21-22
• 2.2.15 單克隆抗體識別表位分析22
• 2.2.16 單克隆抗體的特異性分析22-23
• 2.3 結(jié)果23-26
• 2.3.1 細胞融合及篩選23
• 2.3.2 雜交瘤細胞株穩(wěn)定性的分析23
• 2.3.3 腹水及培養(yǎng)上清效價的測定23
• 2.3.4 單克隆抗體的亞型分析23-24
• 2.3.5 單克隆抗體的純化24-25
• 2.3.6 單克隆抗體相對親和力測定結(jié)果25
• 2.3.7 單克隆抗體結(jié)合位點的分析25-26
• 2.4 討論26-28
• 2.4.1 動物免疫26
• 2.4.2 細胞融合26-27
• 2.4.3 篩選和克隆化27
• 2.4.4 雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇27-28
• 實驗三 牛血紅蛋白ELISA檢測試劑盒的組裝28-42
• 3.1. 方法28-31
• 3.1.1 酶標反應(yīng)板均一性的測定28
• 3.1.2 抗牛血紅蛋白單克隆抗體的辣根過氧化物酶（HRP）標記28-29
• 3.1.3 酶標單克隆抗體反應(yīng)濃度的確定29
• 3.1.4 單克隆抗體包被濃度的確定29
• 3.1.5 單克隆抗體包被條件的確定29
• 3.1.6 封閉液的選擇29-30
• 3.1.7 封閉條件的確定30
• 3.1.8 酶標單抗反應(yīng)時間的確定30
• 3.1.9 雙抗體夾心ELISA操作步驟30-31
• 3.1.10 特異性檢測31
• 3.1.11 穩(wěn)定性試驗31
• 3.1.12 精密度31
• 3.1.13 試劑盒的應(yīng)用31
• 3.2. 結(jié)果31-39
• 3.2.1 酶標反應(yīng)板均一性的測定31-32
• 3.2.2 抗牛血紅蛋白單克隆抗體的辣根過氧化物酶（HRP）標記32
• 3.2.3 酶標抗體反應(yīng)濃度的確定32-33
• 3.2.4 單抗包被濃度的確定33-34
• 3.2.5 包被條件的確定34-35
• 3.2.6 封閉液的選擇35
• 3.2.7 封閉條件的確定35-36
• 3.2.8 酶標單抗反應(yīng)時間的確定36-37
• 3.2.9 特異性檢測37
• 3.2.10 穩(wěn)定性檢測37-38
• 3.2.11 精密度38-39
• 3.4. 討論39-42
• 3.4.1 固相載體39
• 3.4.2 包被39
• 3.4.3 包被蛋白質(zhì)39-40
• 3.4.4 酶結(jié)合物40
• 3.4.5 酶底物40
• 3.4.6 洗滌液與稀釋液40-41
• 3.4.7 結(jié)果判斷41-42
• 第3章 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-44
• 附錄44-48
• 致謝48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及其檢測試劑盒研制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：281611