發(fā)布時(shí)間：2020-09-09 18:57

　　 [目的]通過間接共培養(yǎng)的方法初步探討人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)在體外促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的能力及其影響機(jī)制。[方法]通過酶消化法體外分離培養(yǎng)處于生理性根吸收時(shí)期的自然脫落乳牙牙髓干細(xì)胞;建立SHED與破骨前體細(xì)胞(外周血單個(gè)核細(xì)胞,peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的間接共培養(yǎng)模型,共培養(yǎng)3、7、10、14天。利用TRAP染色觀察PBMCs向破骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化后的細(xì)胞數(shù)目與形態(tài),利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測破骨相關(guān)基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6的表達(dá),以評(píng)估PBMCs向破骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化的情況。在間接共培養(yǎng)模型中加入0、5、10、50、100ng/mL 不同濃度的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western bolt檢測破骨相關(guān)基因及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。利用TNF-α(10ng/mL)模擬炎癥微環(huán)境,利用BAY11-7082抑制NF-κB信號(hào)通路,檢測RANKL/OPG以及NF-κB相關(guān)基因在SHED受到炎癥微環(huán)境作用后的變化。[結(jié)果]與PBMCs單獨(dú)培養(yǎng)組相比,在SHED與PBMCs間接共培養(yǎng)模型中,TRAP染色陽性、具有多個(gè)核的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量顯著增多,破骨相關(guān)基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6在PBMCs中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在一定濃度TNF-α刺激下,破骨相關(guān)基因CTSK、TRAP在PBMCs中的表達(dá)水平顯著上調(diào);RANKL、RANKL/OPG比值、細(xì)胞胞漿內(nèi)p-IκBα和胞核內(nèi)p65在SHED中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在TNF-α刺激的同時(shí)加入BAY11-7082后,破骨相關(guān)基因表達(dá)水平下調(diào)。[結(jié)論]SHED能夠促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化。在炎癥微環(huán)境影響下,SHED的促進(jìn)破骨細(xì)胞形成能力增強(qiáng),;TNF-α能活化NF-κB信號(hào)通路,上調(diào)NF-κB相關(guān)基因的表達(dá),通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG的表達(dá)增強(qiáng)SHED的促進(jìn)破骨細(xì)胞形成能力,這可能促進(jìn)了牙根吸收導(dǎo)致乳牙生理性脫落。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R333.1
【部分圖文】：

２．１邋ＳＨＥＤ原代分離、培養(yǎng)、純化逡逑乳牙牙髓組織通過酶消化法分離得到原代細(xì)胞，培養(yǎng)７天后可見多個(gè)克隆樣的逡逑細(xì)胞團(tuán)形成，細(xì)胞貼壁生長，具有多形性，呈短梭形、多角形等形狀（圖１Ａ）。逡逑通過有限稀釋法挑選單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)１４天左右時(shí)，鏡下可見多個(gè)細(xì)胞團(tuán)匯集成片，逡逑細(xì)胞排列似漩渦、束狀，此為純化的形態(tài)均一的ＳＨＥＤ邋（圖１Ｂ）。逡逑２１逡逑

Ｂ：純化培養(yǎng)后細(xì)胞聚集成片似漩渦（倒置像差顯微鏡，ｘ邋１0０）逡逑２．２邋ＳＨＥＤ間充質(zhì)干細(xì)胞特性的鑒定逡逑經(jīng)過１４天的成骨誘導(dǎo)后，可見大量紅染的礦化結(jié)節(jié)（圖２邋Ａ、Ｂ）；經(jīng)過１４天逡逑常規(guī)培養(yǎng)，可見藍(lán)染的克隆形成單位（圖２邋Ｃ、Ｄ）；經(jīng)過２８天的成軟骨誘導(dǎo)后，逡逑實(shí)驗(yàn)組可見藍(lán)染的粘多糖（圖２邋Ｅ）；經(jīng)過１４天成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞在鏡下可見脂滴逡逑形成（圖２Ｆ）；流式細(xì)胞分析儀結(jié)果顯示，ＳＨＥＤ陽性表達(dá)了邋ＣＤ９０、ＣＤ１０５、逡逑Ｓｔｒｏ－１，而未表達(dá)ＣＤ３４、ＣＤ４５。以上結(jié)果表明ＳＨＥＤ具有間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特性逡逑（圖邋３）。逡逑２２逡逑

＿邋＿逡逑圖２邋ＳＨＥＤ多向分化及克隆形成逡逑：成骨誘導(dǎo)１４天，茜素紅染色（倒置像差顯微鏡，ｘｌ00）；逡逑：常規(guī)培養(yǎng)１４天，克隆形成（倒置像差顯微鏡，ｘｌ00）；逡逑成軟骨誘導(dǎo)２８天，阿利辛藍(lán)染色（倒置像差顯微鏡，ｘ２00）；逡逑成脂誘導(dǎo)１４天，油紅Ｏ染色（倒置像差顯微鏡，ｘ４00）逡逑Ｉ邋９９．６０％邐Ｔ邋９５．１０％—９．１０％逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳小燕;丁寅;金巖;;TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化調(diào)控作用的研究[J];口腔生物醫(yī)學(xué);2015年03期

2 楊杰;趙玉鳴;葛立宏;;恒牙胚缺失動(dòng)物模型的建立及相應(yīng)乳牙牙根的吸收[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年01期

本文編號(hào)：2815341