【摘要】：目的人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種雙鏈DNA病毒,在人群中的感染率普遍存在,并且其分子質(zhì)量較大,屬于皰疹病毒家族中的一員。在病毒感染的初期表現(xiàn)為急性感染,之后HCMV就會(huì)建立起潛伏感染,最終會(huì)伴隨持續(xù)宿主的一生,直至宿主死亡。在病毒感染初期,HCMV早期基因ie2基因會(huì)最早表達(dá),該基因編碼的IE86蛋白在病毒感染過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。但由于HCMV具有嚴(yán)格的種屬特異性,這讓我們?cè)谒拗鬟x擇上遇到了極大的挑戰(zhàn),因此我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型,并對(duì)轉(zhuǎn)ie2基因鼠進(jìn)行荷瘤,在此基礎(chǔ)上我們研究了基因與腫瘤之間的相互作用。方法1.對(duì)轉(zhuǎn)HCMV ie2基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因野生鼠進(jìn)行荷瘤,對(duì)注射腫瘤后小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察并記錄,處死小鼠后對(duì)離體的腫瘤進(jìn)行測(cè)量與檢測(cè),從而確定ie2基因?qū)闪銮昂笮∈笊L(zhǎng)狀態(tài)的影響。2.平行組實(shí)驗(yàn)采用同樣方法對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠進(jìn)行荷瘤,荷瘤成功后不進(jìn)行處死實(shí)驗(yàn),記錄荷瘤鼠的死亡日期,計(jì)算并比較生存率,從而確定ie2基因?qū)闪龊笮∈笊鏍顟B(tài)的影響。3.對(duì)成瘤小鼠的腫瘤組織采用HE染色,進(jìn)一步觀察ie2陽性荷瘤鼠與陰性荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)的差異。4.采用普通PCR的方法對(duì)膠質(zhì)瘤的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子ATF5進(jìn)行定性的檢測(cè),再采用Real-time PCR的方法,對(duì)荷瘤鼠的腫瘤組織和腦部組織中ATF5表達(dá)量多少進(jìn)行定量的檢測(cè),采用Western-blotting的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因荷瘤鼠腫瘤組織中ATF5的表達(dá)量與IE86蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果1.選用了兩種鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261和G422進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),篩選出最易培養(yǎng)、增殖率最高的GL261細(xì)胞進(jìn)行后期荷瘤實(shí)驗(yàn),荷瘤后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ie2基因鼠腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)更迅速且小鼠生存時(shí)間縮短。2.對(duì)離體的腫瘤組織進(jìn)行石蠟切片,HE染色觀察陰性鼠腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)邊界清晰,細(xì)胞疏松;陽性鼠腫瘤組織細(xì)胞不規(guī)則,邊界不清且細(xì)胞密集。3.對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠和未轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行荷瘤,荷瘤后對(duì)腫瘤組織和腦部組織進(jìn)行剝離,之后采用Real-time PCR的方法對(duì)ATF5進(jìn)行定量檢測(cè),可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)HCMV ie2基因鼠和未轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤組織中ATF5均高表達(dá),腦部組織中未見ATF5表達(dá)或可見ATF5低表達(dá)。4.蛋白檢測(cè):對(duì)離體的陽性小鼠腫瘤組織進(jìn)行蛋白提取,采用Westernblotting的方法檢測(cè)ATF5與IE86蛋白之間的定量關(guān)系,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因荷瘤鼠中ATF5呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。結(jié)論1.成功建立了轉(zhuǎn)ie2基因荷膠質(zhì)瘤小鼠動(dòng)物模型,為研究HCMV IE基因及其編碼蛋白IE86在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供思路。2.相比ie2陰性的荷膠質(zhì)瘤小鼠,轉(zhuǎn)ie2基因荷膠質(zhì)瘤小鼠的生存狀態(tài)更差,生存時(shí)間更短;膠質(zhì)瘤標(biāo)志性的轉(zhuǎn)錄因子ATF5的基因和蛋白表達(dá)水平均增高,以上證據(jù)提示:HCMV ie2基因的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4;R-332

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本文編號(hào)：2806018