【摘要】：目的:課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)人脂肪干細(xì)胞(human adipose stem cells,hASCs)來(lái)源外泌體對(duì)急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)大鼠肝組織內(nèi)炎癥及趨化相關(guān)信號(hào)通路具有一定的抑制作用,本研究擬探索外泌體內(nèi)高表達(dá)的具有抑炎作用的miRNA治療ALF大鼠的可能機(jī)制。方法:1、通過(guò)共聚焦顯微鏡、ELISA及流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)外泌體內(nèi)高表達(dá)的具有抑炎作用的miRNA對(duì)D-氨基半乳糖鹽酸鹽(D-gal)聯(lián)合脂多糖(LPS)活化的巨噬細(xì)胞釋放活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、炎癥因子(IL-1α、IL-6及TNF-α)及細(xì)胞凋亡率的影響,篩選出抑炎作用最強(qiáng)的miRNA。2、分別使用外泌體或過(guò)表達(dá)抑炎作用最強(qiáng)的miRNA外泌體治療D-gal/LPS誘導(dǎo)的ALF大鼠,或過(guò)表達(dá)抑炎作用最強(qiáng)的miRNA的慢病毒預(yù)處理大鼠并使用D-gal/LPS誘導(dǎo)其發(fā)生ALF,觀察大鼠生存率、肝功能及肝組織內(nèi)“P47phox-ROS-炎癥因子(IL-10、IL-1α、IL-6、TNF-α)”通路的變化。結(jié)果:外泌體內(nèi)高表達(dá)的六種具有抑炎作用的miRNA中,miR-19b-3p對(duì)活化巨噬細(xì)胞的抑炎作用最強(qiáng),游離形式或外泌體形式miR-19b-3p可顯著抑制活化巨噬細(xì)胞內(nèi)P47phox、ROS及炎癥促進(jìn)性細(xì)胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)炎癥抑制性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-19b-3p外泌體治療或過(guò)表達(dá)miR-19b-3p慢病毒預(yù)處理顯著改善急性肝衰竭大鼠一般情況,24h生存率及肝組織組織病理變化,限制抑制肝組織內(nèi)P47phox、ROS及多種炎癥因子及趨化因子表達(dá)。結(jié)論:過(guò)表達(dá)miR-19b-3p的外泌體可通過(guò)抑制活化巨噬細(xì)胞或ALF大鼠肝組織內(nèi)“P47phox-ROS”通路抑制炎癥因子及趨化因子表達(dá)減輕肝組織炎癥性損傷,從而提高ALF大鼠的生存率。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.3;R-332
【圖文】：

5ul FITC Annexin V 及 5ul PI。輕輕旋渦混勻，室溫避光孵育 15 分鐘。每管中加入 400ul 1X Binding Buffer，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本課題的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，用 ANOVA 統(tǒng)計(jì)多組間差別，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2. 結(jié)果2.1 六種 miRNA 在活化巨噬細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)性如圖 1-1 所示，外泌體內(nèi)高表達(dá)的抑炎相關(guān)六種 miRNA 中，miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p 在活化巨噬細(xì)胞內(nèi)可被檢測(cè)出，而 miR-214-3p、miR-193b-3p 及 miR-29a-3p 均未檢出，推測(cè)活化巨噬細(xì)胞內(nèi) miR-214-3p、miR193b-3p 及 miR-29a-3p 表達(dá)量極低，在后續(xù)的檢測(cè)中將僅針對(duì) miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p。

圖 2-3 共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞內(nèi) ROS 表達(dá)Fig. 2-3 ROS expression in macrophages in each group detected by confocal microscopy.4 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)如圖所示，D-gal/LPS 活化巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子 IL-1α、IL TNF-α表達(dá)量增加，細(xì)胞發(fā)生炎癥性損傷。miR-19b-3p mimic 轉(zhuǎn)染顯著減低化巨噬細(xì)胞內(nèi) IL-1α的表達(dá)（P＜0.05），TNF-α有所下降，但與陽(yáng)性對(duì)照組比無(wú)明顯差異性，與 miR-19b-3p mimic 組相比，inhibitor 轉(zhuǎn)染組活化巨噬細(xì)胞-1α、TNF-α及 IL-6 的表達(dá)均增加，其中 IL-6 具有顯著差異性（P＜0.01）明 miR-19b-3p 可抑制活化巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥促進(jìn)性細(xì)胞因子的表達(dá)，減少炎癥損傷。與 miR-24-3p inhibitor 組相比，活化巨噬細(xì)胞 miR-24-3p mimic 轉(zhuǎn)染組-1α及 TNF-α的表達(dá)均增加，IL-6 的表達(dá)雖較 inhibitor 轉(zhuǎn)染組低，但兩者的達(dá)均較陽(yáng)性對(duì)照組高，說(shuō)明 miR-24-3p 可促進(jìn)活化巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因，加重炎癥性損傷�；罨奘杉�(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-221-3p mimic 后 TNF-α的表達(dá)受

圖 2-5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種 miRNAs 對(duì)活化巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig.2-5 The influence of three miRNAs on the apoptosis of activated macrophages wasdetected by flow表 2-1 各組 miRNA 對(duì)活化巨噬凋亡率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab. 2-1 The statistical data of activated macrophages apoptosis rate treated with differenmiRNA實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞存活率 早期凋亡 晚期凋亡 死亡率NC 85.8% 8.46% 2.41% 2.31%PC 73.7% 20.8% 3.58% 1.93%MiR-19b-3p mimic 77% 15% 4.84% 3.17%MiR-19b-3p inhibitor 9.31% 62.1% 25.6% 2.9%MiR-24-3p mimic 8.04% 64.2% 26.3% 1.52%MiR-24-3p inhibitor 29.8% 62.7% 5.41% 2.17%MiR-221-3p mimic 23.2% 71.2% 5.16% 0.426%MiR-221-3p inhibitor 5.16% 72.6% 20.5% 1.52%

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本文編號(hào)：2802665