【摘要】：研究背景間充質干細胞(MSCs)具有獨特的低免疫原性和免疫調節(jié)作用。脂肪來源間充質干細胞(ASCs)具有取材方便、來源充足等優(yōu)勢,已成為MSCs領域的研究熱點。研究表明,骨髓間充質干細胞(BMSCs)在炎癥微環(huán)境中高表達細胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細胞間黏附分子1(VCAM-1),當封閉這些黏附分子或者促使這些黏附分子無法表達后,BMSCs的免疫抑制能力會顯著降低。ASCs中僅高表達ICAM-1,ICAM-1是否對人ASCs的生物學特性以及免疫抑制功能發(fā)揮重要的調節(jié)作用還未見文獻報道。此外,干擾素-γ(IFN-y)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1 β(IL-1 β)等細胞因子是BMSCs發(fā)揮免疫抑制活性不可缺少的“授權”因子,它們都可以增強BMSCs的免疫抑制能力,而這些細胞因子是否通過ICAM-1影響ASCs的免疫抑制功能尚待探討。明確ICAM-1對ASCs的生物學特性及免疫抑制功能的影響,將為深入了解ASCs的免疫調節(jié)特性及臨床應用提供新的理論依據(jù)。研究目的1.探討ICAM-1對ASCs增殖、凋亡、周期、遷移以及成脂、成骨、成軟骨分化等生物學特性的影響。2.探討ICAM-1對ASCs免疫調節(jié)功能的影響。3.探討TNF-α對ASCs中ICAM-I表達的影響及機制。4.探討適合ASCs的最佳凍存液以及低溫保存對ASCs免疫調節(jié)功能的影響。研究方法1.ICAM-1對ASCs生物學特性的影響采用膠原酶消化法從脂肪組織中獲得ASCs,倒置顯微鏡下觀察,成脂、成骨、成軟骨分化誘導,流式細胞儀進行表面標志物檢測。構建ICAM-1的敲減和過表達質粒,利用慢病毒感染的方法在ASCs中敲減和過表達ICAM-1,CCK-8法檢測ASCs增殖,Muse細胞狀態(tài)分析儀檢測細胞凋亡和周期的變化,劃線法和Transwell法檢測細胞遷移能力的改變,分別使用油紅O、茜素紅和阿利新藍對成脂、成骨、成軟骨誘導后的ASCs進行染色以檢測ASCs的分化能力。2.ICAM-1對ASCs免疫調節(jié)功能的影響提取外周血單個核細胞(PBMC),CFSE染色后,分別按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160的比例接種ASCs和PBMC,顯微鏡下觀察ASCs對PBMC增殖的影響,流式檢測ASCs對PBMC增殖的影響。按照1:10的比例分別以接觸共培養(yǎng)和Transwell隔離共培養(yǎng)的方式接種ASCs和PBMC,顯微鏡下觀察ASCs對PBMC增殖的影響,流式檢測ASCs對PBMC增殖的影響。流式檢測ICAM-1敲減組(shICAM-1組)、ICAM-1敲減對照組(shScramble組)、ICAM-1過表達組(ICAM-1-OV組)和ICAM-1過表達對照組(PCDH組)ASCs對PBMC增殖的影響。3.TNF-α對ASCs中ICAM-1表達的影響以及機制體外分別添加TNF-α和IFN--γ,以及轉化生長因子-β1(TGF-β1)、單核細胞超化蛋白-1(MCP-1)、IL-1 β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 等細胞因子,流式檢測 BMSCs和ASCs中VCAM-1和ICAM-1的表達。采用干細胞培養(yǎng)基、L-DMEM+FBS、L-DMEM+人血清、L-DMEM+血小板裂解液、F12培養(yǎng)基+FBS五種條件進行培養(yǎng),流式檢測不同培養(yǎng)條件下ASCs中ICAM-1的表達。干細胞培養(yǎng)基條件下對ASCs進行傳代培養(yǎng),流式檢測P2到P9不同代數(shù)ASCs中ICAM-1的表達。采用P3代ASCs,流式檢測0.1～100ng/mL不同濃度TNF-α對ASCs中ICAM-1的表達的影響。Reαl-time PCR和流式分別檢測5ng/mL TNF-α在1h、3h、6h、12h、24h、48h時間點對ASCs中ICAM-1基因和蛋白表達量的影響。檢測mTOR通路抑制劑PP242和Rapamycin、JNK通路抑制劑SP600125、MEK1/2通路抑制劑U0126和NF-κB通路抑制劑 BAY11-7082對ASCs中ICAM-1表達量的影響以及TNF-α導致ASCs中ICAM-1表達量變化的影響。4.不同配比凍存液對ASCs生物學特性及ICAM-1的表達和免疫調節(jié)功能的影響分別采用不同比例的FBS和DMSO組合的凍存液凍存ASCs,然后使用Muse細胞分析儀檢測各組細胞的細胞活力;CCK-8法檢測凍存組以及新鮮組ASCs增殖能力;流式檢測凍存組以及新鮮組ASCs細胞表面標志物及ICAM-1的表達;油紅O、茜素紅和阿利新藍染色分別檢測凍存組以及新鮮組ASCs成脂、成骨、成軟骨分化;流式檢測95%FBS和5%DMSO凍存組和新鮮組ASCs對PBMC的體外增殖的影響。研究結果1.ICAM-1對ASCs生物學特性的影響P3代ASCs呈成纖維樣貼壁生長,CD44、CD73、CD90與CD105等MSCs表面標志物均呈陽性表達,而CD45、CD34、CDllb、CD19和HLA-DR呈陰性表達,能夠向成脂、成骨、成軟骨三向分化。在培養(yǎng)第三天時,shICAM-1組ASCs的增殖能力顯著高于shScramble組,而ICAM-1-OV組ASCs的增殖能力則低于PCDH組;敲減、過表達ICAM-1后的ASCs體外凋亡和細胞周期與對照組相比沒有明顯變化;劃線法結果顯示,shICAM-1組ASCs在6h、12 h和24 h細胞遷移距離明顯大于shScramble組,ICAM-1-OV組ASCs在12 h細胞遷移距離明顯小于PCDH組;Transwell法結晶紫染色結果顯示,shICAM-1組ASCs在12 h和24 h細胞遷移數(shù)量明顯多于shScramble組,ICAM-1-OV組ASCs在24 h細胞遷移數(shù)量明顯低于PCDH組;油紅O、茜素紅和阿利新藍染色結果顯示敲減、過表達ICAM-1后ASCs體外成脂、成骨、成軟骨分化能力無變化。2.ICAM-1對ASCs免疫調節(jié)功能的影響倒置顯微鏡下可見,PBMC經(jīng)過PHA刺激后,呈聚集性生長增殖,而加入ASCs后PBMC聚集能力變?nèi)?ASCs比例越高,PBMC的聚集成團能力越弱,ASCs對PBMC增殖的抑制作用與ASCs的比例成正比,ASCs與PBMC比例為1:10和1:20時,與不加ASCs組相比,差異有統(tǒng)計學意義接觸共培養(yǎng)和隔離共培養(yǎng)時,ASCs都能夠抑制PBMC的增殖,但接觸共培養(yǎng)時,ASCs對PBMC增殖的抑制作用更強。shICAM-1組ASCs對PBMC增殖的抑制作用弱于shScramble組,PCDH組ASCs對PBMC增殖的抑制作用與ICAM-OV組相比沒有統(tǒng)計學差異。3.TNF-α對ASCs中ICAM-1表達的影響以及機制TNF-α和IFN-y能夠促進BMSCs中VCAM-1和ICAM-1的表達,但僅能促進ASCs中ICAM-1的表達。促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-1 β能夠促進ASCs中ICAM-1的表達,IL-6、IL-8、MCP-1等促炎因子以及TGF-β1、IL-10、IL-13等抑炎因子則對ASCs中ICAM-1的表達無影響。干細胞培養(yǎng)基組、L-DMEM+FBS組、F12培養(yǎng)基+FBS組、L-DMEM+血小板裂解液組培養(yǎng)的ASCs中ICAM-1為低表達,而L-DMEM+人血清培養(yǎng)的ASCs中ICAM-1為中表達。隨著傳代次數(shù)的增加,ASCs中ICAM-1的表達也逐漸升高。ASCs 分別經(jīng)過 0.lng/mL、0.5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、10ng/mL 的 TNF-α 刺激后,ICAM-1的表達也是逐漸升高,而從lOng/mL的濃度開始,20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100ng/mL的TNF-α對ASCs中ICAM-1的表達變化影響不再明顯。流式結果顯示,5ng/mL的TNF-α刺激ASCs后3h,ICAM-1表面蛋白表達開始升高,持續(xù)到48h。Real-time PCR結果顯示,ASCs分別經(jīng)過5ng/mL的TNF-α刺激lh后,ICAM-1基因的表達即開始升高,6h后逐漸下降。TNF-α主要通過NF-κB信號通路來調節(jié)ASCs中ICAM-1的表達,而mTOR通路、JNK通路以及MEK1/2通路對TNF-α引起的ASCs中ICAM-1的表達無明顯影響。4.低溫保存對ASCs生物學特性及ICAM-1的表達和免疫調節(jié)功能的影響凍存保護劑中,隨著DMSO濃度的增加,ASCs的活力提高,90%FBS和10%DMSO組,95%FBS和5%DMSO組的細胞存活率相似。90%FBS和10%DMSO組,95%FBS和5%DMSO組低溫保存的ASCs顯示出與新鮮ASCs相似的增殖速率、細胞表面標志和分化能力。95%FBS和5%DMSO凍存組ASCs和新鮮組ASCs在抑制PBMC增殖方面沒有統(tǒng)計學差異。研究結論1.敲減ICAM-1促進ASCs的增殖和遷移,過表達ICAM-1抑制ASCs的增殖和遷移,但敲減和過表達ICAM-1對ASCs凋亡、周期和分化無影響。2.ASCs對PBMC有免疫抑制作用,ASCs與PBMC接觸共培養(yǎng)時,ASCs對PBMC增殖的抑制作用更強,敲減ICAM-1后ASCs對PBMC的免疫抑制能力降低。3.ASCs在不同的培養(yǎng)條件以及不同的代數(shù)時,ICAM-1的表達不同;TNF-α和IFN-γ能夠促進BMSCs中ICAM-1和VCAM-1的表達,TNF-α、IFN-γ和IL-1 β能夠促進ASCs中ICAM-1的表達;ASCs中ICAM-1的表達隨著培養(yǎng)條件中TNF-α濃度的增加而升高,在達到10ng/mL及以上濃度時,ICAM-1的表達變化不再明顯;TNF-α主要通過NF-κB信號通路來調節(jié)ASCs中ICAM-1的表達。4.低溫保存能夠維持ASCs的活性、增殖能力、表面標志、分化及免疫調節(jié)潛能;95%FBS和5%DMSO組合是ASCs低溫保存的理想凍存保護劑。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院邐博上研宄生學位論文逡逑（２）成脂、成骨、成軟骨分化實驗具體步驟同前，略。逡逑三、實驗結果逡逑１．敲減／過表達ＩＣＡＭ－１后的ＡＳＣｓ體外增殖能力的變化逡逑應用ＣＣＫ－８法檢測ＩＣＡＭ－１敲減和過表達后ＡＳＣｓ的增殖情況，并繪制出ＤａｙＯ、逡逑Ｄａｙｌ、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、Ｄａｙ７天細胞增殖柱狀圖。如圖１．２．丨所示，各組ＡＳＣｓ均在逡逑Ｄａｙｌ－Ｄａｙ３天處于對數(shù)增長期，Ｄａｙ５－Ｄａｙ７天逐漸進入平臺期。在Ｄａｙ３天時，敲減逡逑組ＡＳＣｓ（ｓｈＩＣＡＭ－ｌ邋）的增殖能力顯著高于對照組（ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ），而過表達組（ＩＣＡＭ－逡逑１－ＯＶ）的增殖能力顯著低于對照組（ＰＣＤＨ），差異有統(tǒng)計學意義。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院邐ｗN－研究生學位論文逡逑（４）用１００吣的１６４０培養(yǎng)基培養(yǎng)，在含５％邋ＣＯ２、３７°Ｃ的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)５ｄ；逡逑（５）流式細胞儀檢測ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ增殖的影響。逡逑三、實驗結果逡逑１．邋ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ的增殖具有抑制作用逡逑倒置顯微鏡下可見，ＰＢＭＣ經(jīng)過ＰＨＡ刺激后，呈聚集性生長增殖，而加入ＡＳＣｓ逡逑后ＰＢＭＣ聚集能力變?nèi)酰粒樱茫蟊壤礁�，ＰＢＭＣ的聚集成團能力越弱（圖１．３．１）。逡逑流式細胞術結果顯示，不加ＡＳＣｓ組的ＰＢＭＣ細胞增殖率為７８．６７±邋５．７７％，而ＡＳＣｓ逡逑與ＰＢＭＣ比例為１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０時，ＰＢＭＣ細胞的增值率分別為逡逑４６．００±７．５６％、５５．０３±６．２４％、７３．６±３．１６％、８３．０３±３．１５％、７２．６±８．３６％，結果表逡逑明ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ增殖的抑制作用與ＡＳＣｓ的比例成正比，ＡＳＣｓ與ＰＢＭＣ比例為逡逑１：１０和１：２０時，與不加ＡＳＣｓ組相比差異有統(tǒng)計學意義（圖１．３．２）。逡逑ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ邐ＡＳＣｓ＋ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ邋（１：１０）逡逑

圖丨．３．２流式檢測ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ增殖的抑制作用逡逑Ａ．流式細胞儀檢測不同比例的ＡＳＣｓ與ＰＢＭＣ共培養(yǎng)后，ＰＢＭＣ的增殖變化Ｂ．ＰＢＭＣ增殖統(tǒng)逡逑計分析（＊＊ｐ＜０．０１，邋＊＊＊／＞＜0．00１）逡逑２．邋ＡＳＣｓ與ＰＢＭＣ接觸共培養(yǎng)和隔離共培養(yǎng)都能夠抑制ＰＢＭＣ的增殖逡逑倒]顯微鏡下可見（圖１．３．３邋Ａ），邋ＰＢＭＣ經(jīng)過ＰＨＡ刺激后，呈明顯的聚集性成逡逑團〔長，ＰＢＭＣ與ＡＳＣｓ接觸兆培養(yǎng)時，ＰＢＭＣ的聚集成團能力變?nèi)酰褂茫裕颍幔睿螅鳎澹欤戾义闲∈覍ⅲ校拢停煤停粒樱茫蟾綦x共培養(yǎng)時，ＰＢＭＣ的聚集成團能力強于接觸共培養(yǎng)，似逡逑５３逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2788527