【摘要】：人嗅黏膜間充質干細胞(Human Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells,OM-MSCs)是一種可進行臨床治療的理想種子細胞。OM-MSCs的旁分泌作用被解釋為其發(fā)揮組織及神經(jīng)修復功能的主要機制,外泌體做為OM-MSCs旁分泌的一種重要的胞外囊泡,對其生物特性進行研究,有著十分重要的臨床價值。外泌體是一種納米級的膜性小泡,其中運載著來源于母細胞的各種蛋白質。盡管外泌體包含的核酸、脂質等功能分子研究火熱,但蛋白質作為生命功能最直接高效的體現(xiàn),其在由外泌體介導的信息傳遞和信號調控中發(fā)揮的作用同樣不容忽視。因此,本研究首先采用組織貼壁法從人嗅黏膜組織中分離培養(yǎng)了OM-MSCs,采用經(jīng)典的超速離心法分離純化了OM-MSCs培養(yǎng)上清中的外泌體,并對分離得到的外泌體的表面標志物、粒子濃度、粒徑分布和形態(tài)學特征進行了分析表征。結果表明,分離得到的OM-MSCs外泌體符合一般外泌體的特征,純度較高且適用于進一步的蛋白質組學分析。為了探究OM-MSCs來源外泌體的蛋白質組成及潛在功能,本研究通過LC-MS/MS質譜對其進行了蛋白質組學分析,并對關鍵蛋白進行了相關的功能驗證。通過質譜分析,共鑒定到304個OM-MSCs來源外泌體的蛋白質,這些蛋白質的亞細胞定位主要為囊泡和外泌體,占總蛋白數(shù)的80.4%,其主要作用于細胞膜上結合受體,并能夠參與正調節(jié)生物進程和系統(tǒng)發(fā)育進程。在構建的候選蛋白質互作網(wǎng)絡中,篩選到了大量與細胞增殖、凋亡、血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)和免疫調節(jié)相關的潛在候選蛋白,通過比對OM-MSCs的分泌組數(shù)據(jù),從蛋白質組學的角度,揭示了OM-MCSs來源外泌體在基于OM-MSCs旁分泌治療機制中的核心作用。這些候選蛋白質多參與了組織創(chuàng)傷修復相關的信號通路,而組織創(chuàng)傷修復的主要生理現(xiàn)象是伴隨著內(nèi)皮細胞增殖遷移導致的血管生成。相關的功能實驗表明,OM-MSCs來源外泌體能被人腦微血管內(nèi)皮細胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cells,HBMECs)攝取,并促進了HBMECs的增殖遷移和體外的血管形成。結合蛋白質組數(shù)據(jù)進行機制分析,其可能主要是通過OM-MSCs外泌體中的HSP90,EGFR,PDGFRB等分子,磷酸化了關鍵蛋白激酶AKT,活化PI3K/AKT信號通路導致的,這暗示了OM-MSCs來源外泌體有著治療腦卒中導致的缺血性腦損傷的潛力。本研究實驗數(shù)據(jù),也為基于OM-MSCs移植的臨床治療,提供了重要的參考依據(jù)。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2
【圖文】：

化成細胞懸液，每管均分 100μL。實驗管中分別加入鼠抗人抗體 CD34- ECD、CD45- PC7、CD90 - FITC、CD34- ECD、CD73- FITC，陰性對照管加入抗IgG-FITC、IgG- PE 室溫孵育 30 min 后，進行流式細胞儀計數(shù)。2.3.3 外泌體的分離純化本實驗選擇了經(jīng)典的差速超速離心法提取 OM-MSCs 培養(yǎng)上清中的外泌體，這種方法被廣泛的用于外泌體的分離純化及下游的蛋白質組學分析，具體流程及步驟如圖所示（圖 2-1）。將含 100% 胎牛血清離心過夜后，收集上清使用 0.22μm針式濾頭除菌，制備成無外泌體血清。稀釋成 10% FBS 的 D/F-12 高糖培養(yǎng)基對分離純化的 OM-MSCs 進行培養(yǎng)，培養(yǎng) 48 小時后收集上清，按照圖中步驟進行外泌體離心分離，所有離心溫度均設置為 4℃。最后收集的沉淀用 1×PBS 重懸，按說明書使用 BCA 試劑盒進行定量，分裝后直接進行下游分析或-80℃保存?zhèn)溆谩?

做好標記。用加樣槍，滴 10 μL 樣本懸液于帶膜銅網(wǎng)上，室溫或37 度烤箱靜置 1-5 分鐘（依據(jù)樣本濃度確定）。然后用剪成尖角的濾紙吸去多余液體，用加樣槍滴 10 μL 磷鎢酸染色液在制好樣品的銅網(wǎng)上，1-2 分鐘后，用剪成尖角的濾紙吸去染色液，再滴一滴純水在銅網(wǎng)上，用濾紙吸去，反復兩三次，洗去多余的磷鎢酸。然后靜置干燥，使用電鏡透射觀察。2.4 結果與討論2.4.1 OM-MSCs 的形態(tài)觀察OM-MSCs 按貼壁法純化培養(yǎng)后，8-9 天后有呈梭狀和多角形狀的細胞從組織塊中延伸而出（圖 2-2A）。培養(yǎng)至 12-14 天，細胞出現(xiàn) 80%~90%的融合，無明顯接觸抑制，可繼續(xù)傳代。傳代后，細胞增殖速度明顯加快，形態(tài)上更為趨同，均為成纖維細胞樣緊密排列，且生長旺盛，與一般的 MSCs 形態(tài)一致（圖 2-2B）。

人嗅黏膜間充質干細胞來源外泌體分離鑒定及蛋白質組學研究2.4.2 OM-MSCs 的細胞表面標志物分析本實驗采用流式細胞術，檢測分離得到的細胞是否為符合相關標準的間充質干細胞。如圖 2-3 所示，實驗分離的 OM-MSCs 不表達造血系干細胞表面蛋白標志物 CD34 和 CD45，表達基質細胞和黏附相關蛋白標志物 CD73、CD90，符合間充質干細胞的表面標志物特性，證明從嗅黏膜中分離的成纖維樣細胞的為間充質干細胞。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 嚴冰浩;張燕;方碩;王越;劉厚奇;;間充質干細胞來源的外泌體的制備方法及應用[J];解剖學雜志;2016年05期

2 孫璇;毛念渝;劉明珠;董傳明;;間充質干細胞來源外泌體在皮膚損傷修復中的研究進展[J];系統(tǒng)醫(yī)學;2019年16期

3 朱慧;朱文俠;黃廣智;馬小娜;;攜載增強型綠色熒光蛋白基因慢病毒標記小鼠臍帶間充質干細胞示蹤方法[J];延安大學學報(醫(yī)學科學版);2019年03期

4 鐘玉蘭;淦鑫;;間充質干細胞源外泌體在肺部疾病中的應用與作用[J];中國組織工程研究;2019年13期

5 劉超;張麗君;陶昊;杜心潔;王芮;李文菁;丁淑梅;王怡;姜磊;黃玉香;;基于細胞生物學方法比較5種不同組織來源間充質干細胞的特征[J];中國組織工程研究;2019年33期

6 徐鄭美;邵立宇;孫宏亮;王瑤;許美花;魯文賡;;間充質干細胞在動物臨床上的應用前景[J];動物醫(yī)學進展;2019年08期

7 唐振霆;施曉雷;;間充質干細胞治療非酒精性脂肪性肝炎的機制及進展[J];肝膽胰外科雜志;2019年08期

8 阿諾得 卡普蘭;廖聯(lián)明;王萍;譚建明;;間充質干細胞更改名稱的時候到了[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2017年05期

9 邱坤銀;廖雄宇;郭淑儀;祁皓寧;藍菁菁;方建培;黃科;黎陽;徐宏貴;周敦華;;間充質干細胞治療兒童難治性遲發(fā)性出血性膀胱炎療效和安全性的臨床研究[J];中國實驗血液學雜志;2018年03期

10 陳俊秋;黃梁滸;;間充質干細胞及其外泌體促血管再生的分子機制研究進展[J];中國實驗血液學雜志;2018年06期

相關會議論文 前10條

1 白雪;霍波;;面積約束情況下形狀對間充質干細胞分化的影響[A];第十一屆全國生物力學學術會議暨第十三屆全國生物流變學學術會議會議論文摘要匯編[C];2015年

2 李坦;劉卓;徐運;;人臍帶間充質干細胞治療脊髓小腦共濟失調3型的研究[A];中華醫(yī)學會第十八次全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編（上）[C];2015年

3 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質干細胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

4 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質干細胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[A];中國解剖學會第十一屆全國組織學與胚胎學青年學術研討會論文匯編[C];2009年

5 張彥;李尚珠;;間充質干細胞在血管工程中的機制及應用[A];2009全國中西醫(yī)結合周圍血管疾病學術交流會論文集[C];2009年

6 石玉;戴\戎;;周期性拉應力對間充質干細胞分化影響的研究[A];第九屆全國生物力學學術會議論文匯編[C];2009年

7 黎嬌;朱爭艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質干細胞分泌物對肝細胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第30次學術年會暨生物醫(yī)學工程前沿科學研討會論文集[C];2010年

8 余慧;黃紅云;陳琳;王洪美;;生物反應器培養(yǎng)間充質干細胞的研究現(xiàn)狀[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

9 覃永亮;曾慧蘭;卜欠欠;鐘啟;韓新愛;;尼古丁誘導人臍帶間充質干細胞凋亡的機制研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

10 喬淑敏;陳廣華;王易;吳德沛;;人臍帶間充質干細胞超微結構觀察[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關重要報紙文章 前10條

1 見習記者 卜葉;科學家勾勒間充質干細胞臨床應用“路線圖”[N];中國科學報;2019年

2 本報記者 劉艷芳;牙髓間充質干細胞填補了干細胞研究的空白[N];廣東科技報;2017年

3 上海生科院 上海交大醫(yī)學院健康科學研究所 曹楷;間充質干細胞：干細胞中的孫悟空[N];上�？萍紙�;2014年

4 第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質干細胞研究又見新方法[N];健康報;2013年

5 劉道安;細胞產(chǎn)品國家工程研究中心啟用間充質干細胞庫[N];健康報;2007年

6 記者　陳建強;首家間充質干細胞庫在津建成[N];光明日報;2006年

7 南方日報記者 嚴慧芳;選擇干細胞儲存須謹慎[N];南方日報;2016年

8 記者 李素鋒;我市首例間充質干細胞移植手術取得成功[N];臨汾日報;2009年

9 馮國梧;全球首個臍帶間充質干細胞庫規(guī)�；\營[N];科技日報;2008年

10 劉瑩清;全球首個臍帶間充質干細胞庫泰達規(guī)模運營[N];北方經(jīng)濟時報;2008年

相關博士學位論文 前10條

1 邵聯(lián)波;低免疫排斥性的間充質干細胞及其外泌體在心肌梗死修復中的機制研究[D];蘇州大學;2018年

2 李成林;人誘導多能干細胞來源的間充質干細胞調控小鼠免疫反應的機制研究[D];廈門大學;2015年

3 馬彩云;間充質干細胞誘導分化為肺泡Ⅱ型上皮細胞修復肺損傷研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2018年

4 浦雯雯;人小涎腺間充質干細胞體外快速成肝誘導相關研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

5 韓兵;脂肪來源間充質干細胞旁分泌因子抗病理性瘢痕成纖維細胞纖維化的作用及分子機制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

6 亓立峰;臍帶間充質干細胞及細胞因子共移植治療腦損傷的分子機理研究[D];山東大學;2018年

7 鄧鑫;PIWIL2在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制以及脂肪間充質干細胞分離鑒定的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

8 朱永朝;人胎盤來源間充質干細胞細胞特性及其生物學功能的研究[D];寧夏大學;2015年

9 段妍;細胞膜片技術的成骨微環(huán)境的研究及新型成骨材料的研發(fā)[D];第四軍醫(yī)大學;2016年

10 易東曄;膠質瘤相關間充質干細胞在膠質瘤微環(huán)境中向血管周細胞分化及其血管生成能力的研究[D];華中科技大學;2018年

相關碩士學位論文 前10條

1 張慶;人腦膠質瘤相關間充質干細胞亞群生物學特性的研究[D];華中科技大學;2019年

2 儀臻;轉錄因子E2F1調節(jié)脂肪間充質干細胞的旁分泌功能及其促進皮膚創(chuàng)面愈合的研究[D];華中科技大學;2019年

3 劉書婷;MiR-26b靶向ROCK1調控間充質干細胞遷移的機制研究[D];蘇州大學;2018年

4 陳哲;SDF-1α通過調節(jié)間充質干細胞miRNA-133的表達促進ITP患者Breg分化[D];南方醫(yī)科大學;2019年

5 徐進;間充質干細胞療法治療糖尿病足潰瘍的Meta分析[D];南昌大學;2019年

6 周瑤;牙髓間充質干細胞治療鼠骨關節(jié)炎的作用與機制[D];南昌大學;2019年

7 尋成峰;人嗅黏膜間充質干細胞來源外泌體分離鑒定及蛋白質組學研究[D];湖南師范大學;2019年

8 林瑤;間充質干細胞來源的外泌體改善骨髓間充質干細胞體外衰老的初步研究[D];深圳大學;2018年

9 張霞;基于合成基因回路的尿酸調控評價研究[D];安徽大學;2019年

10 魏真真;臍帶間充質干細胞對DSS誘導結腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響及相關作用機制探討[D];山西醫(yī)科大學;2016年

本文編號：2784137