【摘要】：金屬元素鎘是分布廣泛的環(huán)境污染物。鎘經(jīng)消化道或呼吸道進入機體后,在多個器官中蓄積,并引起急性或慢性損傷。肝臟是鎘蓄積和損傷的重要靶器官之一,近些年研究發(fā)現(xiàn),鎘能夠誘導(dǎo)肝細胞自噬,并且適當(dāng)?shù)淖允墒羌毎挚规k毒性損傷的保護機制。葛根素是中草藥葛根中的主要化學(xué)成分,具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等多種功效。研究發(fā)現(xiàn),葛根素能夠誘導(dǎo)細胞自噬,減輕鎘引起的細胞損傷,但其具體機制尚不明確。本試驗以小鼠正常肝細胞系A(chǔ)ML12細胞為研究對象,通過氯化鎘與葛根素單獨或聯(lián)合處理細胞,利用細胞分子生物學(xué)相關(guān)方法,探究鎘暴露對肝細胞自噬與溶酶體功能的影響及葛根素的保護效應(yīng),為進一步揭示鎘的毒性機制以及鎘中毒防治提供理論依據(jù)。1.葛根素對鎘致AML12細胞損傷的保護效應(yīng)為了探討葛根素在鎘致AML12細胞損傷中的作用,本研究通過鎘與葛根素單獨或聯(lián)合處理細胞,用xCELLigence細胞實時分析系統(tǒng)(Real-time cell analysis,RTCA)檢測細胞指數(shù)(Cell index,CI),倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài),Hoechst 33258熒光染色觀察細胞核形態(tài),透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,鎘暴露引起AML12細胞損傷,主要表現(xiàn)為抑制CI上升速度;引起細胞形態(tài)與細胞核形態(tài)改變;破壞細胞超微結(jié)構(gòu)。葛根素能夠緩解鎘引起的上述損傷。2.鎘對AML12細胞自噬的影響及葛根素的保護效應(yīng)為了探究自噬在鎘致AML12細胞損傷中的作用,以及葛根素的保護作用。本試驗以5 μM鎘與200μM葛根素單獨或聯(lián)合處理細胞12 h,透射電子顯微鏡觀察自噬小體變化,MDC熒光染色觀察自噬水平變化,免疫熒光法觀察LC3聚點變化;5μM鎘處理細胞不同時間(0、3、6、12、24 h)、不同濃度鎘(0、2.5、5、10μM)處理細胞12 h,免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1、LC3Ⅱ、P62的表達水平;5 μM鎘分別與50 nM Bafilomycin A1(Baf)、200μM葛根素單獨或聯(lián)合處理細胞12h,免疫印跡法檢測細胞自噬流變化;5μM鎘分別與50 nM Baf、50 nM RAPA單獨或聯(lián)合處理細胞,RTCA監(jiān)測CI變化。結(jié)果表明,鎘誘導(dǎo)AML12細胞自噬水平升高,且在5 μM鎘處理細胞12 h時,自噬水平最高(P0.01);鎘暴露引起細胞自噬流阻滯,自噬流阻滯加劇了鎘對細胞的毒性損傷;葛根素可誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬,緩解鎘引起的自噬流阻滯,進而對鎘引起的細胞損傷具有一定的保護效應(yīng)。3.鎘對AML12細胞溶酶體功能的影響及葛根素的保護效應(yīng)為了探討鎘致AML12細胞自噬流阻滯的可能機制,以及葛根素的保護效應(yīng),本試驗以5μM鎘處理細胞不同時間(0、3、6、12、24 h)、不同濃度鎘(0、2.5、5、10、20 μM)處理細胞12 h、5 μM鎘與200 μM葛根素單獨或聯(lián)合處理細胞12 h,通過Lyso-Tracker Red(LTR)熒光染色,觀察細胞溶酶體酸性環(huán)境的變化;免疫印跡法檢測溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、組織蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)以及Rab7的表達。5 μM鎘與200 μM葛根素單獨或聯(lián)合處理細胞12 h、Baf處理細胞12 h、EBSS處理細胞12 h,通過DQ-BSA-Green降解實驗,檢測溶酶體降解功能。50 nM RAPA單獨處理細胞 12 h、5 μM 鎘分別與 200 μM 葛根素、50 nM Thapsigargin(TG)、50 nM Baf單獨或聯(lián)合處理細胞12 h,免疫熒光法觀察LAMP2與LC3共定位情況。結(jié)果表明,鎘暴露引起AML12細胞溶酶體活化,主要表現(xiàn)為溶酶體酸化、LAMP2與CTSB的表達增加;鎘促進溶酶體降解功能但導(dǎo)致LAMP2與LC3共定位減少;此外,鎘抑制Rab7的表達,且呈時間-劑量效應(yīng)關(guān)系;葛根素與鎘共處理可進一步促進溶酶體活化,有效恢復(fù)LAMP2與LC3共定位并增加Rab7的表達。綜上所述,鎘暴露引起AML12細胞損傷,并促進細胞自噬,同時引起自噬流阻滯,自噬流阻滯進一步加劇鎘暴露對細胞的毒性損傷;鎘誘導(dǎo)AML12細胞溶酶體活化,促進溶酶體降解功能,抑制溶酶體與自噬體融合;此外,鎘抑制調(diào)控溶酶體與自噬體融合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白Rap7的表達;葛根素可促進AML12細胞自噬,可緩解鎘引起的細胞損傷,其內(nèi)在機制可能與葛根素恢復(fù)自噬體與溶酶體融合,恢復(fù)Rab7的表達,進而緩解鎘引起的自噬流阻滯有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R-332;R595.2
【圖文】：

能夠清除細胞內(nèi)受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)以及脂滴，并釋放質(zhì)供細胞循環(huán)利用。此外，自噬也能夠清除細胞內(nèi)的病原體，因此，自噬也被認為的一種生存機制［８￣。自噬在生理狀態(tài)與病理狀態(tài)下均可發(fā)生，細胞處于饑餓、缺氧刺激、病原入侵以及其他方式對細胞造成應(yīng)激的狀態(tài)下，自噬可被快速激活，清除物為細胞提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)，在維持細胞內(nèi)細胞器與蛋白質(zhì)的完整性以及免疫調(diào)揮重要調(diào)節(jié)作用［８５，８６］。逡逑如圖１－２－１所示，自噬可分為分子伴侶自噬、微自噬以及巨自噬。分子伴侶自于待降解底物的特定序列（ＫＦＥＲＱ）與分子伴侶熱休克相關(guān)蛋白７０邋（ＨＳＰ７０）的識合，具有高度選擇性。被識別后的底物最終與溶酶體膜上的受體蛋白ＬＡＭＰ－２Ａ結(jié)溶酶體融合進行降解［８６］。與分子伴侶自噬相比，微自噬的過程要相對簡單，微自噬自噬體的參與，對降解底物沒有選擇性。微自噬是溶酶體膜內(nèi)陷直接捕獲受損細胞可溶性蛋白轉(zhuǎn)運入溶酶體降解的過程。但在真核細胞中微自噬很少發(fā)生，介導(dǎo)微自機制尚不明確［８７］。巨自噬是真核細胞中普遍存在的自噬方式，受多種基因調(diào)控，由節(jié)組成，是最復(fù)雜也是最具自噬特征性的自噬方式［８８＃。巨自噬通常被簡稱為自。逡逑

０邐揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑范圍，檢測ＣＩ的變化。結(jié)果如圖２－１－１所示，ＣＩ達到２．５？３時，細胞進入快速生長期，逡逑速生長期是處理細胞的最佳時期，根據(jù)實驗需要同時為了方便安排實驗時間，最終選擇逡逑孔接種１．２Ｘ１０４個細胞進行后續(xù)實驗，待ＣＩ達到２．５？３時處理細胞。逡逑－５０００邋１邐＊邋＊邋——１邋？邐Ｉｌｌｌ－ｉ－邋ＩＩ邋ＭｌｉｌｌｌｌｌＪｉｉｈｎｔ邋．ｎｍｉｌＭ邋ｉｎｉｌ－邋ＭＰ邋ｍｎ－邋；邋？逡逑．．

２－１－５Ａ）。與Ｃｏｎｔｒｏｌ組相比，Ｐｕｅ組細胞增殖速度與細胞形態(tài)無顯著差異，Ｃｄ單獨處理組逡逑細胞X椫乘俁燃躉海赴翁浠饗圓⒊魷炙勞魷赴揮耄茫淶ザ來磣橄啾齲校酰逵脲義希茫涔泊磣�，细胞形态变化优d航猓ㄍ跡玻保靛澹攏Ｌ崾荊茫湟鸕模粒停蹋保蠶赴鶘順叔義鮮奔洌亮啃в叵擔(dān)校酰蹇苫航猓茫湟鸕南赴鶘�，与＿b裕茫練從車慕峁恢�。辶x希玻掣鷥卦陲又攏粒停蹋保蠶赴誦翁鶘酥械謀；ぷ饔緬義媳臼匝榻岷瞎鄄煜赴誦翁謀浠�，进一步探锑嵜ｄ謹n粒停蹋保蠶赴拘運鶘思埃校酰邋義系謀；ぷ饔謾２煌ǘ

本文編號：2768026