發(fā)布時間：2017-03-30 02:19

  本文關(guān)鍵詞：干酪乳酸桿菌代謝物對白假絲酵母菌生物被膜體外抑菌效果及分子機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的隨著癌癥放、化療和器官移植患者的增加,免疫抑制劑和廣譜抗生素的大量使用以及醫(yī)學植入裝置如導尿管、人工心瓣膜和置換關(guān)節(jié)等醫(yī)學材料使用的增多,以白假絲酵母菌為代表的念珠菌感染率和病死率均逐年快速增長,約占醫(yī)源性感染的50%。生物被膜是粘附于活體或非活體組織表面,由自身產(chǎn)生胞外多聚基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)包裹的具有三維立體結(jié)構(gòu)的菌細胞群體。生物被膜是微生物主要的生存方式,和浮游細胞相比,80%的微生物感染是由生物被膜引起的。生物被膜作為天然屏障可顯著降低白假絲酵母菌對抗真菌藥物的敏感性,產(chǎn)生高度耐藥和持續(xù)感染。研究表明,白假絲酵母菌生物被膜對常見的抗真菌藥物存在明顯的耐藥性,如兩性霉素B、氟康唑、特比萘芬、制霉素等。生物被膜形成后藥物的50%抑菌濃度可增加到原來的10倍,而80%抑菌濃度將增加到原來的30到2000倍,極大地限制了生物被膜相關(guān)感染的防治。與治療細菌感染相關(guān)的龐大的、多門類的抗生素家族不同,抗真菌藥物的選擇具有很大的局限性。唑類在淺表性真菌感染的應用極為廣泛,但自身的毒性作用不容忽視,而且真菌對其耐藥性已廣泛存在。以卡泊芬凈為代表的棘白菌素類藥物可以抑制細胞壁p-1,3-葡聚糖的合成,雖然對生物被膜感染極為有效,但也存在抗真菌譜窄的缺憾。因此尋找高效、廣譜、無毒的抗真菌藥物是臨床上亟待解決的難題。乳酸桿菌是一種革蘭氏陽性益生菌,它廣泛存在人體胃腸道、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和口腔等。乳酸桿菌通過發(fā)酵碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類等產(chǎn)生多種代謝物。其中,乳酸、過氧化氫及細菌素具有抗菌作用。據(jù)文獻報道,乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白假絲酵母菌有抑菌作用,并且對人體無毒副作用。因此,乳酸桿菌代謝物非常有潛力開發(fā)作為治療白假絲酵母菌生物被膜感染的非抗生素類藥物。目前國內(nèi)外并沒有干酪乳酸桿菌代謝物對體外白假絲酵母菌生物被膜抑菌效果和抑菌途徑的報道。本實驗將檢測干酪乳酸桿菌代謝物是否對體外白假絲酵母菌生物被膜具有抑菌作用,并且通過蛋白組學技術(shù)進一步研究干酪乳酸桿菌代謝物的抑菌機制。方法1.將含有干酪乳酸桿菌代謝物的固體培養(yǎng)基搗碎,通過萃取、蒸餾的方式濃縮干酪乳酸桿菌代謝物。2.采用XTT減低法測定干酪乳酸桿菌代謝物對白假絲酵母菌游離態(tài)及生物被膜態(tài)的最小抑菌濃度(MICso)。3.定量檢測不同濃度的干酪乳酸桿菌代謝物對白假絲酵母菌生物被膜形成、成熟階段的體外代謝活動的影響。4.通過時間殺菌曲線檢測干酪乳酸桿菌代謝物的濃度和作用時間對白假絲酵母菌生物被膜的影響。5.在干酪乳酸桿菌代謝物的刺激下,使用倒置顯微鏡觀察白假絲酵母菌酵母相向菌絲相的形態(tài)學轉(zhuǎn)變。6.梯度微量稀釋法(棋盤法)檢測干酪乳酸桿菌代謝物與兩性霉素B的聯(lián)用對白假絲酵母菌生物被膜的體外抑菌效果。7.實時定量PCR檢測干酪乳酸桿菌代謝物對白假絲酵母菌中ALS1、ALS3、 HWP1、BCR1、EFG1、TEC1六種基因的差異表達。8.采用雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)對比干酪乳酸桿菌代謝物處理前后白假絲酵母菌蛋白質(zhì)的表達差異,利用MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀對差異蛋白進行分析,通過BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,明確蛋白質(zhì)的名稱和作用。結(jié)果1.干酪乳酸桿菌代謝物作用于白假絲酵母菌浮游細胞、生物被膜的MIC80分別為1：256和1：128。菌株YEM30對干酪乳酸桿菌代謝物敏感,代謝物的體外抑菌活性較強。2.干酪乳酸桿菌代謝物可以抑制白假絲酵母菌生物被膜的形成和成熟的生物被膜,抑菌效果與代謝物的濃度正相關(guān)。3.干酪乳酸桿菌代謝物明顯抑制生物被膜中白假絲酵母菌的代謝活性,隨著藥物濃度的升高,抑菌作用明顯增強。4.干酪乳酸桿菌代謝物可以阻斷白假絲酵母菌形態(tài)學的轉(zhuǎn)變并呈現(xiàn)出濃度依賴性。隨著干酪乳酸桿菌代謝物濃度的升高,白假絲酵母菌量減少、菌絲的生長受到不同程度的抑制。5.干酪乳酸桿菌代謝物單用或與AMB聯(lián)用時,藥物的抑菌率從50%提升至84%。兩藥聯(lián)用能夠減少AMB的使用劑量,降低藥物的毒副作用,從而達到理想的治療效果。6. ALS1、ALS3、HWP1、BCR1、EFG1、TEC1六種基因在干酪乳酸桿菌代謝物處理前后的表達量并沒有出現(xiàn)顯著變化,無統(tǒng)計學意義。7.從雙向電泳圖譜上獲得6個顯著蛋白斑點,對其中4個進行鑒定。在干酪乳酸桿菌代謝物的刺激下,烯醇酶(Eno1)、蘋果酸脫氫酶(Mdhlp)、泛素連接酶(Ubrl)表達升高,己糖激酶(HK)表達下降。結(jié)論干酪乳酸桿菌代謝物對白假絲酵母菌生物被膜的形成和成熟兩個階段均存在抑制作用,并能干擾白假絲酵母菌酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變。表達量上調(diào)的烯醇酶、蘋果酸脫氫酶、泛素連接酶和下調(diào)的己糖激酶通過參與免疫應答、群體感應、菌絲生長的途徑來抑制白假絲酵母菌生物被膜的形成。綜上所述,干酪乳酸桿菌代謝物作為非抗生素類抗真菌藥物具有潛在的應用價值。
【關(guān)鍵詞】：白假絲酵母菌 生物被膜 干酪乳酸桿菌代謝物 抑菌作用 雙向電泳
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R379
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-18
• 實驗材料18-22
• 實驗方法22-31
• 實驗結(jié)果31-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 綜述40-49
• 參考文獻49-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文目錄57-58
• 附件58

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本文編號：276009