【摘要】：近年來(lái)隨著微生物學(xué)研究的深入開(kāi)展,越來(lái)越多的新發(fā)致病性微生物與臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。病毒作為微生物的一種,它也會(huì)對(duì)動(dòng)物以及人類(lèi)的健康構(gòu)成威脅。隨著社會(huì)發(fā)展,人類(lèi)的活動(dòng)日益頻繁,經(jīng)貿(mào)往來(lái)、跨國(guó)旅游、城市化進(jìn)程以及森林砍伐等不斷加劇導(dǎo)致了病毒性的疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)增加。同樣,新型病毒感染導(dǎo)致的疾病也越來(lái)越多。報(bào)道顯示,有些病毒可以在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏存在而不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物明顯的臨床癥狀,但如果病毒發(fā)生跨種間動(dòng)物傳染至人則會(huì)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的臨床癥狀,比如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、SARS病毒、MERS病毒等。因此,解析動(dòng)物以及人體內(nèi)特定微環(huán)境病毒的構(gòu)成、比較兩者之間病毒組成的差異,并挖掘其中潛在具有致病性的新型病毒具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。目前傳統(tǒng)的病毒分析方法如細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR、ELISA等方法對(duì)于新型病毒的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)具有較大的局限性。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和生物信息學(xué)的發(fā)展,病毒宏基因組學(xué)(Viral metagenomics)應(yīng)運(yùn)而生。病毒宏基因組學(xué)是以特定環(huán)境中全部病毒基因的總和─包括全部真核生物病毒和原核生物病毒(噬菌體)核酸為研究對(duì)象,以不依賴(lài)于有機(jī)體培養(yǎng)的技術(shù)手段,對(duì)該環(huán)境樣品中病毒多樣性、種群結(jié)構(gòu)、互作關(guān)系進(jìn)行全面研究的新型病毒學(xué)研究方法。該方法突破了傳統(tǒng)方法對(duì)于病毒研究的限制,可以有效地用于特定樣品病毒群落解析。為了探究和比較奶牛與人生殖道微環(huán)境內(nèi)病毒群落構(gòu)成,并挖掘生殖道微環(huán)境內(nèi)新型病毒,本研究采用病毒宏基因組學(xué)的方法對(duì)奶牛與人的生殖道拭子樣本構(gòu)建病毒宏基因組文庫(kù),采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,深入分析文庫(kù)內(nèi)病毒基因序列并形成病毒群落結(jié)構(gòu)。本課題研究的主要內(nèi)容包括:(一)奶牛生殖道病毒組研究對(duì)采集的80份健康奶牛生殖道拭子樣品病毒群落解析,結(jié)果顯示奶牛生殖道病毒群落在科水平上包括:雙鏈DNA(ds DNA)病毒:腺病毒科(Adenoviridae)0.0797%、囊泡病毒科(Ascoviridae)0.5503%、桿狀病毒科(Baculoviridae)0.3068%、皰疹病毒科(Herpesviridae)5.7212%(其中包含異皰疹病毒科Alloherpesviridae0.0746%)、乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)1.1159%、多瘤病毒科(Polyomaviridae)0.1029%、痘病毒科(Poxviridae)38.4279%。雙小RNA病毒科(Picobirnaviridae)0.0771%。反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)0.7688%。單鏈DNA(ss DNA)病毒:圓環(huán)病毒科(Circoviridae)8.6781%、Genomoviridae病毒科7.035%、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)0.2237%、小環(huán)狀DNA病毒科(Smacoviridae)8.3027%、分類(lèi)不明的單鏈DNA病毒(Unclassified ss DNA Virius)27.1657%。ss RNA病毒:星狀病毒科(Astroviridae)0.0180%、冠狀病毒科(Coronaviridae)1.2162%、小RNA病毒科(Picornaviridae)0.0103%。未分類(lèi)的RNA病毒(Unclassified RNA Virius)0.198%。奶牛生殖道病毒群落的組成特點(diǎn):(1)病毒群落組成多樣性高。(2)其中哺乳動(dòng)物病毒序列占比高達(dá)65.2945%。(3)包含1株新型乳頭瘤病毒(Papillomavirus)。(4)包含2種牛多瘤病毒bovine polyomaviruses。(5)包含6株新型CRESS-DNA病毒。(二)人生殖道病毒組研究對(duì)采集的100份人陰道拭子病毒群落進(jìn)行解析,結(jié)果顯示人陰道病毒群落在科水平上的構(gòu)成是:雙鏈DNA(ds DNA)病毒:囊泡病毒科0.1173%、桿狀病毒科0.2346%、皰疹病毒科0.2346%、乳頭瘤病毒科51.1928%、痘病毒科2.3465%。反轉(zhuǎn)錄病毒科15.4869%。肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)0.0782%。單鏈DNA(ss DNA)病毒:指環(huán)病毒科(Anelloviridae)29.2912%、細(xì)小病毒科0.0391%。單鏈RNA(ss RNA病毒):星狀病毒科0.0391%、小RNA病毒科0.8604%和一些分類(lèi)不明的單鏈DNA病毒(Unclassified ss DNA Virius)0.0391%。未分類(lèi)的RNA病毒0.0391%。人陰道病毒群落的組成特點(diǎn):(1)病毒序列豐度高。(2)其中哺乳病毒序列占比達(dá)99.6872%。(3)包含1株新的人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)。(4)包含3株新型指環(huán)病毒(Anellovirius)序列。(三)奶牛與人生殖道病毒群落的比較奶牛與人生殖道病毒群落在構(gòu)成上具有相同點(diǎn)亦有差異之處,主要表現(xiàn)在,奶牛生殖道病毒群落多樣性大于人生殖道病毒群落。人生殖道內(nèi)存在指環(huán)病毒,而奶牛生殖道不含此類(lèi)病毒。(四)新型病毒的發(fā)現(xiàn)及其系統(tǒng)進(jìn)化分析(1)新型乳頭瘤病毒在奶牛生殖道拭子Cattle S02號(hào)文庫(kù)以及人生殖道拭子LVS02號(hào)文庫(kù)中分別發(fā)現(xiàn)一株新型乳頭瘤病毒。乳頭瘤病毒科家族具有高度多樣性,該病毒是雙鏈環(huán)狀DNA病毒,大小約為8kb,具有高度保守的開(kāi)放閱讀框(ORF)L1區(qū)。在奶牛生殖道Cattle S02號(hào)文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的新型乳頭瘤病毒命名為bovine papillomavirus ujs-21015,全長(zhǎng)7398bp,包含早期基因E6(1-426bp)、E7(428-751bp)、E1(738-2564bp)、E2(2506-3747bp)和晚期基因L1(5376-6887)、L2(3828-5369bp)以及長(zhǎng)鏈非編碼區(qū)LCR(6888-7389),基于L1蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,該毒株屬于Dyoxipapillomavirus病毒屬內(nèi)的新種(species)。在人生殖道LVS02號(hào)文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的新型乳頭瘤病毒命名為new HPV全長(zhǎng)7354bp,包含早期基因E7(195-494)、E1(475-2379)、E2(2321-3487)和晚期基因L2(3551-5164)和L1(5085-6710),同樣基于L1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該毒株是Gammapapillomavirus病毒屬內(nèi)的新種(species)。(2)新型CRESS-DNA病毒CRESS-DNA病毒是能夠編碼蛋白的一類(lèi)環(huán)形的單鏈DNA病毒,它主要編碼的蛋白有Rep蛋白和Cap蛋白。CRESS-DNA這一類(lèi)病毒包含有Circoviridae、Geminiviridae、Nanoviridae等。本研究在奶牛生殖道病毒組文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)6株新型CRESS-DNA病毒,分別命名為C0101(2,255 bp)、C05001(2,562 bp)、C042793(2,958bp)、C021765(2,727 bp)、C025899(2,734bp)、C013782(3,085bp),其中C0101、C05001和C042793與圓環(huán)病毒科(Circoviridae)中的部分病毒相似,C021765和C025899與環(huán)狀病毒相似,C013782與Genomoviridae中的gemycircularvirus相似。(3)多瘤病毒在奶牛生殖道拭子Cattle S05號(hào)文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)多瘤病毒基因序列,經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)文庫(kù)中含有兩株不同的多瘤病毒毒株,分別與多瘤病毒BPy V1(KM496323)和BPy V2(KX455486)具有較近的親緣關(guān)系。多瘤病毒在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)中分布廣泛,大部分哺乳動(dòng)物的多瘤病毒可以導(dǎo)致有免疫力的宿主存在持續(xù)性的無(wú)癥狀感染,部分多瘤病毒經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)可以致病免疫力低下的宿主。本次研究在奶牛生殖道發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒BPy V1和BPy V2之前在牛肉中也被發(fā)現(xiàn)過(guò),目前對(duì)于該病毒在宿主中是否存在于其它部位尚不清楚,本次在奶牛生殖道中發(fā)現(xiàn)這兩株病毒可能對(duì)于該病毒的傳播方式有一定的提示意義。(4)新型指環(huán)病毒人生殖道病毒群落內(nèi)含有高豐度的指環(huán)病毒序列,經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析后得到3株指環(huán)病毒基因組中的最大開(kāi)放閱讀框(ORF1),3株指環(huán)病毒序列分別命名為ujs0601、ujs0801、ujs0804,經(jīng)過(guò)比對(duì)后確認(rèn)該3株均為新型指環(huán)病毒序列。指環(huán)病毒為單鏈環(huán)狀DNA病毒,主要包括3個(gè)編碼區(qū),目前研究認(rèn)為ORF1所編碼的蛋白在基因組復(fù)制的過(guò)程中起作用。指環(huán)病毒是廣泛存在于人的體液當(dāng)中。該病毒與疾病的關(guān)聯(lián)性還不是十分清楚,有待于將來(lái)基于特定疾病的流行病學(xué)研究來(lái)闡明其與生殖道相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)性。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R373;S852.65
【圖文】：

圖 1.1 病毒宏基因組學(xué)研究路線(xiàn)Fig.1.1 The research route of viral metagenomics學(xué)已經(jīng)成為從臨床樣本中發(fā)現(xiàn)新病毒的最有力工用病毒宏基因組學(xué)方法。作為一種無(wú)偏差（unb毒宏基因組學(xué)的方法容易受到低病毒-宿主e ratios）等因素的影響[28, 29]。在有些樣品中病毒樣品中存在的細(xì)菌和真核生物的核酸，這些因素此，富集病原體的遺傳物質(zhì)和消除宿主本身遺傳如今有一系列的病毒富集方法包括物理方法和酶如通過(guò)反復(fù)凍融裂解細(xì)胞釋放病毒粒子，通過(guò)不 μm）和離心，酶消化宿主基因組等[30-33]。

2.2 病毒宏基因組文庫(kù)質(zhì)量控制及結(jié)果分析2.2.1 病毒宏基因組文庫(kù)質(zhì)量控制我們利用 1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)觀察文庫(kù)篩選前后的 DNA 片段分布情況。如圖2.1 所示：A 圖當(dāng)中 1-5 代表的是奶牛生殖道拭子病毒宏基因組文庫(kù) CattleS01-CattleS05，6-15 代表的是人生殖道拭子病毒宏基因組文庫(kù) LVS01- LVS10。B 圖是文庫(kù)混合后經(jīng)過(guò)篩選純化后的電泳結(jié)果。

圖 2.3 奶牛生殖道病毒組構(gòu)成-科水平Fig.2.3 The virome composition of bovine genital tract- Family屬水平上：鏈 DNA（dsDNA）病毒：腺病毒科中含有 Aviadenovirus、Mastadeno科中含有 Ascovirus、Toursvirus；桿狀病毒科中含有 Alphabacuculovirus ； 皰 疹 病 毒 科 中 含 有 Cyprinivirus 和 Alloherpesverpesvirinae、Gammaherpesvirinae 三個(gè)亞科，其中 Gammaherpesvirinaacavirus 和 Rhadinovirus；乳頭瘤病毒科中含有 Dyokappapillomavirus 以乳頭瘤病毒科；分類(lèi)不明的多瘤病毒科；痘病毒科中含有 Chordopoxvpoxvirinae 兩個(gè)亞科，除了這兩個(gè)亞科中分類(lèi)不明的，其中 Chordop有 Avipoxvirus、Orthopoxvirus、Parapoxvirus，Entomopoxvirinae 亞科ntomopoxvirus、Betaentomopoxvirus。 RNA 小病毒科中含有 Picobirnavirus。

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