【摘要】：肝細胞受損并累積可引發(fā)肝臟疾病,肝細胞受損程度和肝功能的實時檢測評價,對于預防、早期診斷和治療肝臟疾病具有重要意義。甘膽酸是膽汁酸的主要成分之一,由膽固醇與肝內(nèi)的甘氨酸結合而成,研究指出,甘膽酸經(jīng)腎臟排泄明顯,與肝膽疾病的嚴重程度相關,是評價肝臟功能的一項很重要的指標。因此,檢測尿液中的甘膽酸對臨床檢測有一定指導價值,且臨床上檢測甘膽酸多為取靜脈血,對于小兒患者和不便于取靜脈血的患者,檢測其尿液中的甘膽酸有著其便利性與對疾病診斷的研究意義。本研究首先通過細胞融合獲得甘膽酸(GCA)的單克隆抗體,同時建立基于甘膽酸單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器、免疫層析試紙條和化學發(fā)光免疫分析方法。具體的實驗內(nèi)容包括以下幾個方面:1、甘膽酸單克隆抗體的制備及表征本實驗采用活潑脂法合成的免疫抗原GCA-BSA并免疫雌性Balb/C小鼠,經(jīng)過細胞融合,獲得能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株GCA-BSA-5H2。采用腹水誘生法獲得大量單克隆抗體,先通過辛酸-硫酸銨法初步純化,再通過Protein G柱純化和單克隆抗體亞型分型試劑盒鑒定其亞型為IgG1型。2、建立基于甘膽酸單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器本實驗將不同稀釋度的甘膽酸單克隆抗體注入富集有包被抗原GCA-OVA的CM5芯片,測得單克隆抗體與甘膽酸之間的親和力為Kd=1.983*10-9M。建立基于甘膽酸單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器的標準抑制曲線。IC50為39.8ng/mL,線性范圍是13.3-119.4ng/mL。除了與牛黃膽酸(TCA)的交叉反應率達40%,其他的膽酸結構類似物與對應抗體的交叉反應率均小于10%。為了驗證基于單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器,利用間接競爭ELISA與其進行比較,兩者具有很強的相關性(R2=0.9983)。3、建立基于甘膽酸單克隆抗體的免疫層析試紙條本實驗制備了平均粒徑約為115.45±10.53nm聚苯胺-金納米粒子,以聚苯胺-金納米粒子為標記物制備了聚苯胺-金納米試免疫層析紙條,對基于甘膽酸單克隆抗體的免疫層析試紙條進行方法學考察,研究結果表明,該試紙條特異性好,重復性高,性能穩(wěn)定,可將其應用于尿液樣品中甘膽酸的定性檢測。4、基于甘膽酸單克隆抗體的化學發(fā)光免疫分析方法將聚苯胺-金納米粒子(PPAuNP)標記IgG-HRP,確定CLIA方法的最優(yōu)工作條件為包被時間為1.5h,封閉為0.75h,抗原抗體反應時間為0.75h,標記的IgG-HRP與抗體反應時間為0.75h,發(fā)光底物作用時間為4min。利用GCA建立標準曲線,所建立方法的檢測范圍(IC15-IC85)為 161.99-61929.99 ng/mL,IC5G值為 274.82,最低檢測限(LOD,IC10)為56.26 ng/mL。并對334份人體尿液樣本進行檢測,慢性肝炎,肝硬化和肝腫瘤組尿液樣品中的GCA濃度分別是健康對照組的6.3倍,9.1倍和10.1倍(P0.001),陽性率分別為86.4%、78.9%、63.7%。綜上所述,本研究制備獲得可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株GCA-BSA-5H2。以甘膽酸的單克隆抗體為基礎分別建立了表面等離子共振生物傳感器、免疫層析分析方法和化學發(fā)光免疫分析方法。通過對尿液中甘膽酸的定性檢查,可在在早期篩查中快速判斷病變標志物(甘膽酸)是否異常,而甘膽酸的定量檢測結果表明,甘膽酸在不同肝臟疾病中的含量存在明顯的差異,說明甘膽酸水平的高低與肝臟病理損害程度密切相關。通過與臨床指標AST、ALT、AFP相比較,甘膽酸在能夠更好的反映潛在的慢性肝損傷,在判斷肝硬化與肝腫瘤方面優(yōu)于AST、ALT、AFP指標。本實驗中所研究的免疫學分析方法都可以對甘膽酸進行有效的檢測,可實現(xiàn)對肝功能的監(jiān)控。
【學位授予單位】：廣東工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392-33;O657.3;TQ464
【圖文】：

甘膽酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＡ）化學式為Ｃ２６Ｈ？Ｎ0６，分子量為：４６５．６２，微溶逡逑于水，無氣味，為白色結晶粉末，熔點為１２８°Ｃ。其中文別名為Ｎ－（３，７，１２－三羥基－２４－逡逑羰基膽烷－２４－基）－甘氨酸。它的分子結構式如圖１－１所示。逡逑？Ｈ六逡逑Ｖ逡逑十0丫ＮＨ逡逑ＨＯ、、、０Ｈ逡逑Ｈ逡逑圖１－１甘膽酸的化學結構逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２甘膽酸的臨床意義逡逑在肝細胞中，甘膽酸是由甘氨酸和膽酸所形成的結合膽汁酸，甘膽酸為膽酸的主逡逑要成分之一，甘膽酸以蛋白結合的形成存在于血清中［Ｍ１。在正常情況下，甘膽酸由肝逡逑細胞合成分泌而成，經(jīng)過毛細膽管、膽管排入膽襄，再通過膽汁回流到十二指腸中，逡逑協(xié)助食物的消化。最后，９５％的甘膽酸會回到腸末端被重新吸收，經(jīng)門靜脈回到肝臟，逡逑此過程被稱為腸－肝循環(huán)（圖１－２）邐由此可知，若門靜脈重吸收的甘膽酸可以被肝逡逑臟高效的回收，則再次進入體循環(huán)的甘膽酸不達總量的百分之一，故而血液中甘膽酸逡逑的含量較低，可當肝臟受到損傷之后，經(jīng)門靜脈重吸收的甘膽酸則不能有效的被肝細逡逑胞所吸收

甘膽酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＡ）化學式為Ｃ２６Ｈ？Ｎ0６，分子量為：４６５．６２，微溶逡逑于水，無氣味，為白色結晶粉末，熔點為１２８°Ｃ。其中文別名為Ｎ－（３，７，１２－三羥基－２４－逡逑羰基膽烷－２４－基）－甘氨酸。它的分子結構式如圖１－１所示。逡逑？Ｈ六逡逑Ｖ逡逑十0丫ＮＨ逡逑ＨＯ、、、０Ｈ逡逑Ｈ逡逑圖１－１甘膽酸的化學結構逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２甘膽酸的臨床意義逡逑在肝細胞中，甘膽酸是由甘氨酸和膽酸所形成的結合膽汁酸，甘膽酸為膽酸的主逡逑要成分之一，甘膽酸以蛋白結合的形成存在于血清中［Ｍ１。在正常情況下，甘膽酸由肝逡逑細胞合成分泌而成，經(jīng)過毛細膽管、膽管排入膽襄，再通過膽汁回流到十二指腸中，逡逑協(xié)助食物的消化。最后，９５％的甘膽酸會回到腸末端被重新吸收，經(jīng)門靜脈回到肝臟，逡逑此過程被稱為腸－肝循環(huán)（圖１－２）邐由此可知，若門靜脈重吸收的甘膽酸可以被肝逡逑臟高效的回收，則再次進入體循環(huán)的甘膽酸不達總量的百分之一，故而血液中甘膽酸逡逑的含量較低，可當肝臟受到損傷之后，經(jīng)門靜脈重吸收的甘膽酸則不能有效的被肝細逡逑胞所吸收

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本文編號：2739772