發(fā)布時間：2017-03-29 00:15

  本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌溶血素HlyA的原核表達、多抗制備及相關(guān)功能探析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是一種重要的食源性致病菌,可引起人或幼畜(初生羔羊、犢牛及斷奶仔豬)的腹瀉,是斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌,其高發(fā)病率和高死亡率的特點給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。K88ac+ETEC血清型為國內(nèi)初生及斷奶仔豬腹瀉的優(yōu)勢血清型,其主要毒力因子包括黏附素菌毛、腸毒素、內(nèi)毒素、水腫病毒素、溶血素等。ETEC的黏附素菌毛、不耐熱腸毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)、耐熱性腸毒素(Heat-stable enterotoxin, ST)等毒力因子受到廣泛關(guān)注,但作為尿路致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)、腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhage Escherichia coli, EHEC)重要毒力因子的溶血素在ETEC致病機理中的功能卻鮮有報道,故本研究選擇K88ac+ETEC作為試驗對象,初步探究溶血素在ETEC致病中的作用。通過PCR方法擴增負責表達大腸桿菌C83902溶血素亞單位HlyC、HlyA的基因hlyC, hlyA,將其克隆至原核表達載體pET-28a(+),構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-hlyCA,經(jīng)酶切驗證、測序,確定質(zhì)粒的成功構(gòu)建。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞后,經(jīng)IPTG誘導和Ni-NTA親和層析獲得高純度的融合蛋白HlyA。純化后的重組蛋白用兩種方法免疫新西蘭白兔,獲得特異性較高的兔源抗HlyA多克隆抗體血清。本研究構(gòu)建、表達并獲得高純度的融合蛋白HlyA,經(jīng)免疫后成功獲得兔源HlyA抗體,為進一步探究大腸桿菌溶血素HlyA的生物學功能及致病機理奠定基礎(chǔ)。利用ETEC標準株C83902、已構(gòu)建的溶血素hlyA基因缺失株C83902A hlyA和回補株C83902A hlyA/phlyA,通過熒光定量PCR從轉(zhuǎn)錄水平研究溶血素與ETEC其他重要毒力因子的關(guān)系,初步探索了溶血素在細菌胞外的存在形式,并對仔豬空腸上皮細胞IPEC-J2細胞系進行了粘附和粘附抑制試驗、細胞形態(tài)學觀察、細胞毒性試驗等一系列功能性探索。Real-time PCR試驗結(jié)果表明溶血素的缺失使得sepA(編碼絲氨酸蛋白酶主要結(jié)構(gòu)亞基)的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了83%(p0.01),fimH(編碼Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基)和eltB(編碼熱不穩(wěn)定腸毒素主要結(jié)構(gòu)亞基)分別下調(diào)約40%和21%(p0.01),faeG(編碼K88菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基)顯著下調(diào)了約24%(p0.05),而對fliC(編碼鞭毛絲蛋白主要結(jié)構(gòu)亞基)的轉(zhuǎn)錄無顯著影響。上述結(jié)果表明溶血素與絲氨酸蛋白酶可能存在相互調(diào)控機制,且溶血素的表達可能與細菌對宿主細胞的黏附有關(guān)。對外膜囊泡(outer membrane vesicle, OMV)及溶血素進行分離鑒定后,發(fā)現(xiàn)溶血素除游離形式存在外,還能以與外膜囊泡結(jié)合的形式存在于細菌上清中,驗證了外膜囊泡可以作為溶血素運輸載體的假說。IPEC-J2的細胞黏附與黏附抑制試驗結(jié)果表明溶血素缺失株組的細菌粘附數(shù)量為野生株組的2.13倍(p0.01),細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)溶血素作用后形態(tài)變圓變小,且細胞毒性試驗結(jié)果表明溶血素可引起細胞死亡,綜合IPEC-J2細胞的各項試驗可以說明溶血素對仔豬空腸上皮細胞具有細胞毒性,且可能降解細胞間連接蛋白,因而引起上皮細胞脫落從而使得細菌可以從腸道排出,這種排菌機制理論與溶血素缺失株細菌黏附數(shù)量提高的試驗結(jié)果相一致。
【關(guān)鍵詞】：K88ac~+ETEC 溶血素HlyA 原核表達 多克隆抗體 OMV 黏附 細胞毒性
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61;R378
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 符號說明11-12
• 文獻綜述12-25
• 1. 溶血素的表達與調(diào)控12-13
• 1.1 溶血素操縱子12
• 1.2 基因的調(diào)控12-13
• 2. HlyA的加工與分泌13-14
• 2.1 HlyC的�；饔�13
• 2.2 Ⅰ型分泌系統(tǒng)13-14
• 3. HlyA的運輸形式14-16
• 4. Hly與其他毒力因子的相互作用16-17
• 5. HlyA與宿主細胞的相互作用17-20
• 5.1 細胞脫落作用17-18
• 5.2 宿主的炎性反應(yīng)18
• 5.3 促凋亡作用18-19
• 5.4 促吞噬作用19
• 5.5 促氧化作用19-20
• 參考文獻20-25
• 研究一 ETEC大腸桿菌溶血素HlyA的原核表達、純化及多克隆抗體的制備25-40
• 1. 材料26-27
• 1.1 菌株、質(zhì)粒26
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑26
• 1.3 實驗動物26
• 1.4 主要儀器26-27
• 2. 方法27-33
• 2.1 引物設(shè)計及合成27
• 2.2 PCR擴增目的基因27-28
• 2.2.1 PCR模板的制備27
• 2.2.2 PCR反應(yīng)體系與程序27-28
• 2.3 PCR產(chǎn)物純化與回收28
• 2.4 氯化鈣法制備DH5口感受態(tài)細胞28
• 2.5 連接與轉(zhuǎn)化28-29
• 2.5.1 克隆片段與T載體連接28-29
• 2.5.2 連接片段導入感受態(tài)細胞29
• 2.6 陽性克隆的篩選與鑒定29-30
• 2.6.1 堿裂解法小提質(zhì)粒29
• 2.6.2 鑒定及測序29-30
• 2.7 重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定30-31
• 2.7.1 酶切與連接30
• 2.7.2 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備30
• 2.7.3 電轉(zhuǎn)化30
• 2.7.4 鑒定及測序30-31
• 2.8 HlyA在pET-28a(+)載體中的原核表達31-32
• 2.8.1 HlyA重組蛋白的表達條件分析31
• 2.8.2 HlyA重組蛋白的表達及表達形式分析31-32
• 2.9 HlyA重組蛋白的變性、純化、復性與濃縮32
• 2.10 HlyA重組蛋白Western-blot鑒定32
• 2.11 HlyA重組蛋白兔源多抗血清的制備與鑒定32-33
• 2.11.1 動物免疫32-33
• 2.11.1.1 弗氏佐劑免疫32
• 2.11.1.2 QuickAntibody快速佐劑免疫32-33
• 2.11.2 ELISA測定血清效價33
• 2.11.3 HlyA重組蛋白兔源多抗的Western-blot檢測33
• 2.11.4 HlyA重組蛋白兔源多抗血清的采集分離33
• 3. 結(jié)果33-38
• 3.1 hlyCA的PCR產(chǎn)物鑒定33-34
• 3.2 重組表達質(zhì)粒pET-28a-hlyCA鑒定及其單雙酶切鑒定34-35
• 3.3 HlyA重組蛋白的誘導條件和表達形式分析35-37
• 3.4 HlyA重組蛋白的純化與Western blot鑒定37-38
• 3.5 重組蛋白HlyA兔源多克隆抗體的制備及鑒定38
• 4. 討論38-40
• 研究二 ETEC溶血素HlyA的生物學功能研究40-58
• 1. 材料41-42
• 1.1 菌株、細胞41-42
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑42
• 1.3 主要儀器42
• 2. 方法42-47
• 2.1 qRT-PCR檢測野生株、突變株和回補株中相關(guān)基因表達量變化42-45
• 2.1.1 設(shè)計引物42-43
• 2.1.2 Trizol法RNA抽提43
• 2.1.3 cDNA的合成43-44
• 2.1.4 PCR鑒定cDNA44
• 2.1.5 qRT-PCR反應(yīng)44-45
• 2.2 溶血素表達形式的鑒定45
• 2.2.1 外膜囊泡及溶血素的分離45
• 2.2.2 外膜囊泡及溶血素的Western blot鑒定45
• 2.3 IPEC-J2細胞的體外粘附試驗45-46
• 2.3.1 IPEC-J2細胞的培養(yǎng)與傳代46
• 2.3.2 IPEC-J2細胞的黏附試驗46
• 2.3.3 IPEC-J2細胞的黏附抑制試驗46
• 2.3.4 IPEC-J2細胞的血清黏附抑制試驗46
• 2.4 IPEC-J2細胞形態(tài)學變化觀察46-47
• 2.5 IPEC-J2細胞毒性試驗47
• 3. 結(jié)果47-55
• 3.1 熒光定量PCR檢測hlyA基因缺失對其它毒力因子的影響47-48
• 3.2 溶血素表達形式的鑒定48-49
• 3.3 IPEC-J2細胞的黏附試驗和黏附抑制試驗49-52
• 3.3.1 IPEC-J2細胞的黏附試驗49-50
• 3.3.2 IPEC-J2細胞的黏附抑制試驗50-51
• 3.3.3 IPEC-J2細胞的血清黏附抑制試驗51-52
• 3.4 HlyA對IPEC-J2細胞形態(tài)的影響52-54
• 3.5 HlyA對IPEC-J2細胞的細胞毒性試驗54-55
• 4. 討論55-58
• 4.1 熒光定量PCR檢測hlyA基因缺失對其它毒力因子的影響55
• 4.2 溶血素表達形式的鑒定55-56
• 4.3 IPEC-J2細胞黏附試驗和黏附抑制試驗56-58
• 參考文獻58-59
• 全文總結(jié)59-60
• 致謝60-61

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1 Beutin L;王韌;;大腸桿菌的幾種溶血素[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1992年06期

2 李濤;吳后波;;最小弧菌熱不穩(wěn)定型溶血素表達載體的構(gòu)建和高效表達[J];臺灣海峽;2007年02期

3 張衍海;白艷艷;張彥明;鄭增忍;張寶;童光志;;產(chǎn)單核細胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表達[J];中國預防獸醫(yī)學報;2008年11期

4 陳希;索占偉;許劍琴;穆祥;;細菌溶血素的分類及代表性溶血素研究進展[J];中國農(nóng)學通報;2008年08期

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本文編號：273330