【摘要】：先天性黑蒙癥(Leber's Congenital amaurosis,LCA)是發(fā)生最早、最嚴(yán)重的遺傳性視網(wǎng)膜病變,全球新生兒患病率是1/35,000。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT1)廣泛表達于各個組織,催化NAD+的生物合成。NMNAT1基因突變可以導(dǎo)致第9型先天性黑蒙癥,患者在出生后2個月即表現(xiàn)出視網(wǎng)膜萎縮、眼球震顫等癥狀。攜帶NMNAT1無義突變的患者,在剛出生時即可檢測到黃斑缺損。NMNAT1突變基因?qū)е翷CA的機制尚不清晰,但絕大多數(shù)研究將致病原因歸根于NMNAT1突變引起的蛋白酶活力的降低。目前為止,LCA9尚無有效的治療方法。為研究NMNAT1突變的致病機制,實驗室根據(jù)患者的突變位點,利用PCR定點突變技術(shù)構(gòu)建了NMNAT1突變基因,將野生型及突變后NMNAT1插入不同質(zhì)粒中,構(gòu)建突變型及野生型 pEGFP-NMNAT1,pCMV-NMNAT1 及 pET30a-NMNAT1 重組質(zhì)粒。通過細胞免疫熒光實驗確定兩個無義突變(Trp85*和Trp169*)改變NMNAT1蛋白的細胞定位,從而影響蛋白功能的發(fā)揮。體內(nèi)酶活實驗及體外酶活實驗分別用于檢測突變對NMNAT1酶活力的影響。酶活力檢測實驗結(jié)果顯示Va198Gly突變催化合成的NAD+量明顯下降,提示Va198Gly突變顯著降低蛋白酶活力。由于NMNAT1是穩(wěn)定的6聚體結(jié)構(gòu),半衰期較長,很難通過細胞實驗觀測到突變對蛋白穩(wěn)定性的影響。所以通過使用生物信息學(xué)分析,預(yù)測各個突變點對NMNAT1基因內(nèi)作用力的影響,判斷突變氨基酸對蛋白穩(wěn)定性的影響。突變后蛋白內(nèi)部雖然并未形成Clash/Contact鍵,但氫鍵及疏水鍵的分布均發(fā)生顯著變化。收集體外表達的蛋白,經(jīng)圓二色譜檢測后發(fā)現(xiàn),Met35Thr,Va198Gly,Val151Phe突變后蛋白螺旋結(jié)構(gòu)減少,Leu 153Val,Glu257Lys,Asn273Asp突變后蛋白螺旋結(jié)構(gòu)增多。提高蛋白外部環(huán)境溫度,實時觀察二級結(jié)構(gòu)的變化,發(fā)現(xiàn)突變后蛋白解旋溫度變小(Tm),螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。為研究LCA9型疾病的治療方法,使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),根據(jù)患者突變類型構(gòu)建NMNAT1-LCA9小鼠模型,通過視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG),眼底成像及光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)檢測檢測小鼠的表型。眼底成像結(jié)果顯示,小鼠出生3個月后眼底出現(xiàn)針尖樣白點,但視網(wǎng)膜各層并未出現(xiàn)異常,視網(wǎng)膜層狀結(jié)構(gòu)完整。觀察至32周可見眼底病癥加劇,針尖樣白斑分布密集,但視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)仍保持完整,并無缺損。與Va1152Leu/Glu258Lys 和 Glu258Lys/Glu258Lys 突 變相比Met172Aspfs*22/Glu258Lys小鼠眼底表型出現(xiàn)較早,后期表型惡化嚴(yán)重,眼底針尖樣白斑分布更為密集。組織切片結(jié)果顯示,早期NMNAT1-LCA9小鼠視網(wǎng)膜并未發(fā)生明顯變化,8個月之后,視網(wǎng)膜外核層、外網(wǎng)狀層及內(nèi)核層均變薄。此外,NMNAT1-LCA9小鼠的光感受器功能也在8個月后顯著降低。視網(wǎng)膜的層狀結(jié)構(gòu)具有基因治療的先天的優(yōu)勢,眼病的基因治療更是走在疾病基因治療的前列,目前LCA2型的基因治療已完成了臨床3期實驗。通過對NMNAT1-LCA9小鼠模型視網(wǎng)膜下腔注射AAV2-CMV-NMNAT1,探索LCA9型疾病基因治療的可行性。在注射小鼠4個月后對其進行ERG檢測,檢測結(jié)果顯示小鼠的光感受器功能得到改善,但隨著小鼠周齡增加,光感受器功能逐漸降低。所以AAV2-CMV-NMNAT1基因治療所使用的病毒計量仍需摸索,以達到降低細胞毒性、提高治療效果的目的。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R774;R-332
【圖文】：

大腸桿菌中表達ＮＭＮＡＴ１蛋白，純化后經(jīng)Ｘ－ｒａｙ得到ＮＭＮＡＴ１蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。逡逑Ｗｅｒｎｅｒ發(fā)現(xiàn)ＮＭＮＡＴ１為六聚體蛋白，并得出ＮＭＮＡＴ１－煙酰胺單核苷酸相互作用逡逑模式。此項發(fā)現(xiàn)為ＮＭＮＡＴ１－配體結(jié)合提供了理論基礎(chǔ)（圖１．２）。之后，ＳｏｒｃｉＬ［６］逡逑等確定了邋ＮＭＮＡＴ１在尼克酸胺腺３票呤二核苷酸（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ邋ａｄｅｎｉｎｅ邋ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，逡逑ＮＡＤ＋）的生物合成過程的重要作用。Ｓｏｒｃｉ在發(fā)現(xiàn)ＮＭＮＡＴ１催化Ｎ－甲基煙酰胺逡逑（Ｎ－Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＭＮ）與三淲酸腺苷（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ邋ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，邋ＡＴＰ）反應(yīng)生成逡逑ＮＡＤ＋的同時也可以催化煙酸單核苷酸（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，邋ＮａＭＮ）與逡逑ＡＴＰ反應(yīng)生成ＮＡＤ＋［６］（圖］．３），并且在兩種催化途徑中ＮＭＮＡＴ１的催化效率逡逑相同。此外，ＮＭＮＡＴ１也可以利用瘦峻咬林（ｔｒｉａｚｏｆｈｒｉｎ邋ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，邋ＴｒＭＰ）逡逑作為催化底物。在催化合成ＮＡＤ＋的同時，ＮＭＮＡＴ１也催化逆向反應(yīng)的發(fā)生，例逡逑如ＮＡＤ％焦磷酸化分裂。在催化逆向反應(yīng)時

ｐＥＧＦＰ－Ａ＾ＭＡ＾ｒ／，ｐＣＭＶ－滈視４７７及ｐＥＴ３０ａ－７ＶＭＡ＾７７。利用質(zhì)粒通用測序引物（表逡逑２．３）對各個重組質(zhì)粒進行測序驗證，之后挑取符合條件的質(zhì)粒，－２0°Ｃ保存?zhèn)溆�。逡逑如圖２．１所示，８夂突變位點的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖２．１）。逡逑＇邐＜；＊＊邐＇邋＊邋Ｉ邋Ａ邋？邐＇邐？邐？？邐、邋Ｖ邋Ｉ邐％邐％邐Ｖ邋＼邐＼邐？．邐？．邋Ｉ邋＜邐＼邐？邐（，邐（邐｜邐？．邐＜邐｜邐（，邐｜邐？，邐｜邐（，（，逡逑＇邐＊？邐？＊邐＇邋ｆ邋？邐＇邐＇邐、邐《邐？？邐＾邐＾邐％邐％邐＾邐％邐＼邋Ｉ．邋＜．邋Ｉ邋（邐１邐％邐（．邋Ｉ．邋Ｉ邋（．邐（邋ｔ邋＜．邋Ｉ邋４

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3 陳守寧;;先天性黑蒙兩個家系報告[J];上海醫(yī)學(xué);1983年04期

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本文編號：2727119