發(fā)布時(shí)間：2020-06-20 00:44

【摘要】：背景:乙肝病毒(HBV)感染是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,全球60億人口中約有20億人感染過HBV,其中慢性HBV感染約有2.57億人,約占全球人口的4%。由于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能,在宿主免疫壓力和抗病毒藥物的作用下,病毒本身會(huì)不斷發(fā)生變異、進(jìn)化,形成新的基因型。目前HBV共可分為A-J10個(gè)基因型,每個(gè)基因型又可分為多個(gè)亞型,隨著HBV研究的進(jìn)一步深入,越來越多的基因型和亞型陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)經(jīng)生物信息學(xué)的不斷發(fā)展,不同基因型間的重組毒株相繼被發(fā)現(xiàn)。廣西是我國乙肝病毒流行率較高的地區(qū),該地區(qū)HBV基因分型相對復(fù)雜,其中B型和C型較為常見,基因型I(重組型)在一些地區(qū)的流行率也較高。2011年,本課題組研究發(fā)現(xiàn):在廣西那坡縣863名HBsAg攜帶者中,有6名利用HBV S區(qū)基因序列進(jìn)行基因分型時(shí)無法分型或者兩次分型結(jié)果不一致,提示該地區(qū)可能存在未知基因型的HBV或者重組型毒株。目的:對在廣西那坡縣發(fā)現(xiàn)的未能分型HBV毒株進(jìn)行全基因組測序和生物信息學(xué)分析,確定其基因分型,分析毒株的基因序列特征。方法:查找2011年采集的血清標(biāo)本及其基本信息,并與當(dāng)?shù)丶部刂行穆?lián)系,在征集乙肝病毒攜帶者同意后,于2018年再次采集其血清標(biāo)本。利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA法)對乙肝病毒血清標(biāo)志物進(jìn)行定性檢測,采用PCR熒光探針法檢測乙肝病毒載量,采用酚、氯仿法提取乙肝病毒核酸,使用巢式PCR擴(kuò)增HBV全長基因,并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序,使用Sequencher 5.1軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接整理,在NCBI GenBank中檢索涵蓋A-I的9個(gè)基因型的HBV全基因組序列作為參考序列,利用Mega6.0、Bioedit 7.2.6、RDP4等軟件對所獲得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:(1)基本情況:通過查找2011年采集的血液標(biāo)本以及2018年新采血液樣本,收集了6例乙肝病毒攜帶者共11份血液樣本,其中8份標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增、基因測序獲得相應(yīng)的全基因組序列,3份在經(jīng)PCR擴(kuò)增全基因組序列時(shí)失敗,未能獲得全基因組序列。(2)NP137病毒攜帶者:此攜帶者有2011及2018年采集的兩份血清標(biāo)本,分別為NP137Q和NP137,后者HBV-DNA載量為567.71IU/mL。兩份標(biāo)本的血清學(xué)檢測結(jié)果相同:HBsAg陽性、HBsAb陰性、HBeAg陰性、HBeAb陽性和HBcAb陽性。通過對PCR產(chǎn)物克隆,每份標(biāo)本分別挑取15個(gè)陽性克隆株,全部獲得完整的全基因組序列。對獲得的全基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):該攜帶者2011年感染的病毒基因型為B型(3株)、D型(8株)以及未知基因型(4株);2018年感染的病毒基因型僅為D型(15株)。30個(gè)克隆株中有23株(2011年8株,2018年15株)單獨(dú)聚集成簇,且不與D基因型的其他亞型成簇,Bootstrap值為100%。與D1-D10各亞型間的核苷酸差異4%,提示這是新的基因亞型,因此,將該新基因亞型命名為D11亞型。與其他D基因亞型毒株相比,共發(fā)現(xiàn)37個(gè)氨基酸為新亞型毒株所特有,其中15個(gè)氨基酸在新亞型毒株中均含有。23株新亞型毒株血清型均為ayw2,15株在preC區(qū)1896位出現(xiàn)由G到A的突變,導(dǎo)致終止密碼子的產(chǎn)生。在所有的毒株中均未有A1762T/G1764A雙突變以及C1766T突變和T1768A突變。然而,23個(gè)毒株中有18個(gè)存在T1753C突變。2011年標(biāo)本獲得的15條克隆株中有3株毒株為B2亞型,4株毒株為B/D重組毒株,其重組親本為B2亞型和D11亞型毒株。B2亞型以及其中3株重組毒株的血清型為adw2,NP137Q-20毒株的血清型為adw。(3)NP911病毒攜帶者:此攜帶者有2011及2018年采集的兩份血清標(biāo)本,分別為NP911Q和NP911,標(biāo)本NP911Q血清學(xué)檢測結(jié)果:HBsAg陽性、HBsAb陽性、HBeAg陰性、HBeAb陽性和HBcAb陽性。標(biāo)本NP911血清學(xué)檢測結(jié)果:HBsAg陽性、HBsAb陰性、HBeAg陰性、HBeAb陽性和HBcAb陽性,HBV-DNA載量為3.23?10~7IU/mL。通過對PCR產(chǎn)物克隆,樣本NP911共得到10個(gè)克隆株,全部獲得完整的HBV全基因序列。NP911Q因在巢式PCR擴(kuò)增時(shí)失敗,未能獲得該樣本的全長基因序列。對標(biāo)本NP911獲得的克隆株進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):10株克隆毒株均存在缺失突變,基因型為I1,前C區(qū)存在G1896A突變,10株克隆株均為A1762T/G1764A BCP雙突變毒株。(4)NP808、NP872和NP634病毒攜帶者:前兩者有2011及2018年采集的兩份血清標(biāo)本,后者僅有2011年采的標(biāo)本,它們分別為NP808、NP808Q、NP872、NP872Q和NP634Q病毒攜帶者,他們感染的乙肝病毒均為C1基因亞型,HBsAg陽性,血清型均為adrq~+。未發(fā)現(xiàn)G1896A突變及A1762T/G1764A BCP雙突變。(5)NP422病毒攜帶者:有2011及2018年采集的兩份血清標(biāo)本,分別為NP422Q和NP422,但在全基因組PCR擴(kuò)增時(shí)失敗,未獲得全基因組序列。結(jié)論:(1)感染研究對象NP137的部分乙肝病毒株屬于新的基因亞型,命名為D11亞型。(2)感染研究對象NP137的部分乙肝病毒株屬于新的重組型毒株:B/D重組毒株。(3)當(dāng)乙肝病毒攜帶者體內(nèi)存在不同基因型HBV混合感染時(shí),將PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序,用獲得的序列進(jìn)行基因分型,結(jié)果不可靠,需用克隆測序獲得的序列進(jìn)行分型。(4)當(dāng)乙肝病毒攜帶者體內(nèi)存在不同基因型HBV混合感染時(shí),因病毒復(fù)制存在消長現(xiàn)象,在不同時(shí)間點(diǎn)檢測病毒基因型,會(huì)出現(xiàn)分型結(jié)果不一致的現(xiàn)象。(5)當(dāng)存在基因重組或使用S基因序列不能確定病毒基因型時(shí),要通過全基因組序列進(jìn)行分型。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373.21
【圖文】：

- 43 -圖 3-1 S 基因區(qū)部分氨基酸序列Fig 3-1 Partial amino acid sequence of the S gene2.2 全基因組序列基因分型為了解上述獲得的 HBV 基因組全長序列在系統(tǒng)進(jìn)化中的位置及分類，確定相應(yīng)毒株的基因型，通過與從 NCBI Gen Bank 數(shù)據(jù)庫檢索到的 57 條HBV 全基因參考序列進(jìn)行序列比對，采用鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，詳見圖 3-2。

廣西那坡縣乙型肝炎病毒基因型研究 2016 級碩士研究生學(xué)位論文示。另外，10 株毒株在 nt801 出發(fā)生堿基突變，使密碼子由 TTA 變?yōu)?TGA（終止密碼子）導(dǎo)致 S 蛋白不能完整表達(dá)。由于缺失突變發(fā)生在開放讀碼框內(nèi)，并未引起 DNA 聚合酶發(fā)生改變。nt3048-3113 缺失導(dǎo)致編碼前 S1 蛋白的氨基酸序列在 68-89 處缺失 22 個(gè)氨基酸，nt36-53 缺失導(dǎo)致編碼前 S2蛋白的氨基酸序列在 17-22 處缺失 6 個(gè)氨基酸。10 株毒株在前 C 區(qū)存在G1896A 突變，導(dǎo)致該區(qū)編碼氨基酸的第 28 位由色氨酸（TGG）突變?yōu)榻K止密碼子（TAG），表達(dá)使 HBeAg 轉(zhuǎn)錄過早終止，影響了 HBeAg 的表達(dá)，與血清學(xué)檢測結(jié)果一致。10 株克隆株在 nt1762 和 nt1764 處存在A1762T/G1764ABCP 雙突變。

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