發(fā)布時間：2020-06-18 19:30

【摘要】：痘苗病毒(Vaccinia virus,VV)曾經(jīng)作為疫苗預防天花,并幫助人類最終消滅天花。此后,痘苗病毒多被改造為活病毒載體,應用于抗AIDS、流感等感染性疾病及腫瘤的疫苗研究。至今已有多個痘苗病毒為載體的疫苗進入了臨床研究階段。然而,痘苗病毒是一種基因組巨大、基因數(shù)量眾多的DNA病毒,尚存有許多未知需要深入研究。為適應各種不同應用需要,痘苗病毒還需要進一步改造和優(yōu)化。痘苗病毒主要形成2種感染形式的病毒顆粒:胞內(nèi)成熟病毒(intracellular mature virus,IMV)和胞外囊膜病毒(extracellular enveloped virus,EEV)。與占絕大多數(shù)的IMV相比,EEV占比小于1%,但具有早釋放、早感染、遠距離傳播等優(yōu)勢。因此,我們推測改變痘苗病毒EEV的釋放可能會對病毒的感染及其免疫原性產(chǎn)生影響。EEV的釋放包含兩個關鍵步驟:依賴微管的運輸以及從細胞膜上的解離。本研究以天壇株痘苗病毒(Tiantan Vaccinia Virus,VTT)為研究對象,選擇可能與痘苗病毒EEV釋放的兩個關鍵步驟相關的基因進行缺失或突變改造,比較研究了改造后病毒的復制、EEV的釋放特性及外源抗原的表達,評估和篩選出能促進抗原免疫應答的新型重組痘苗病毒載體。一,本研究試圖通過對病毒依賴微管的運輸相關的A36R、F12L基因進行缺失改造,改變病毒依賴微管的EEV釋放,從而促進病毒向粘膜基底面的釋放。由于F12L基因缺失的重組病毒rVTT△F12L-GFP難以擴增,我們重點分析了A36R基因缺失的重組病毒rVTT△A36R-GFP與野生型VTT在病毒復制和EEV釋放方面的差別。體外結果發(fā)現(xiàn),重組病毒rVTT△A36R-GFP在非極化的黏膜上皮細胞Caco-2中的EEV釋放和病毒復制能力下降;在極化的Caco-2細胞transwell系統(tǒng)中,病毒向腔面和底側面的釋放均下降。小鼠體內(nèi)實驗結果發(fā)現(xiàn),重組病毒rVTT△A36R-GFP在小鼠鼻和肺組織中復制產(chǎn)生的總病毒量顯著減少。上述結果表明:缺失A36R基因導致痘苗病毒EEV釋放減少,在粘膜細胞和體內(nèi)局部的復制下降,不是一種合適的改造方案。二,本研究試圖通過對病毒從細胞膜上解離相關的A34R、B5R基因進行點突變改造,從而增加EEV的釋放。結果發(fā)現(xiàn)與野生型病毒(VTT)相比,重組病毒rVTT-B5R_(mut)僅能輕微增加EEV的釋放和總子代病毒的產(chǎn)生,而rVTT-A34R_(mut)則能顯著增強EEV的釋放和總子代病毒的產(chǎn)生。因此,我們以rVTT-A34R_(mut)為載體,插入HIV env蛋白作為模式抗原,構建了重組HIV疫苗rVTT-A34R_(mut)-Env。與對照病毒rVTT-Env相比,rVTT-A34R_(mut)-Env在體外細胞系和小鼠肌肉組織中均顯著提高了子代病毒的產(chǎn)生和外源抗原的表達量,并最終在小鼠體內(nèi)誘導了更強的HIV Env特異性的細胞和抗體應答水平。此外,重組疫苗rVTT-A34R_(mut)-Env表現(xiàn)出較低的細胞毒性和動物毒性,具有較好的安全性。上述結果表明:能增強EEV釋放的重組病毒rVTT-A34R_(mut)是一種能增強重組疫苗免疫原性的新型重組痘苗病毒疫苗載體。此外,本研究通過對一株已進入臨床研究的痘苗病毒載體疫苗VTKgpe的A34R基因點突變改造,有效提高了其誘導的HIV Env特異的抗體應答,證明了A34R點突變也能在其他痘苗病毒載體疫苗中起到增強免疫應答的效應,表明通過A34R基因K151E點突變增強EEV的釋放是一種能提高免疫原性的重組痘苗病毒載體改造方案。綜上所述,本論文系統(tǒng)研究了改變痘苗病毒本身EEV釋放特性的改造方案對重組病毒復制,外源抗原表達和重組疫苗免疫原性的影響。本研究篩選出了一種高效安全的新型VTT疫苗載體rVTT-A34R_(mut),并證明了A34R點突變的改造方式同樣適用于其他痘苗病毒載體。因此,本研究不僅為如何構建更安全高效的痘苗病毒疫苗載體提供了一個實例,更提供了一種新的思路。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 莊柯;針對HIV-1 B’亞型首株SHIV及減毒痘苗病毒載體重組疫苗的構建[D];武漢大學;2005年

本文編號：2719727