【摘要】：細胞分裂分為對稱細胞分裂(SCD)和不對稱細胞分裂(ACD)。不對稱和對稱有絲分裂之間的平衡在整個生命周期的時間和空間上必須得到精確控制。協(xié)調細胞不對稱分裂需要控制大量的細胞內外生物過程和信號網(wǎng)絡,這些事件的干擾導致細胞群內自我更新和分化的動態(tài)改變,這與癌癥的生長和進展高度相關。染色體DNA的非隨機分離是細胞不對稱分裂中的一個關鍵科學問題,即攜帶母本舊DNA鏈的染色單體僅由兩個子細胞之一繼承。雖然這一現(xiàn)象已經在幾個物種和細胞類型中觀察到,但我們對非隨機DN A分離的機制和生理相關性知之甚少。已有研究顯示,肌肉干細胞的不對稱細胞分裂頻率受氧張力的顯著影響;骨骼肌急性組織損傷中,也可以觀察到肌肉干細胞中的染色體的非隨機分離[62];人肺癌細胞中也描述了在染色體模板DNA鏈的非隨機分離與細胞接觸、高細胞密度、低氧(1%)和血清剝奪相關。這些證據(jù)都提示了染色體DNA非隨機分離可能受到微環(huán)境的調控。此外,染色體的成功復制,及隨后在有絲分裂期間的均勻分離對基因組穩(wěn)定性維持至關重要。研究證明復制壓力受微環(huán)境的精細調控,且對基因組的穩(wěn)定性維持至關重要。因此,我們猜想,復制壓力是否誘導了染色體DNA的差異化,進而影響了染色體DNA的非隨機的分布。本團隊在人骨肉瘤(U-20S)細胞上利用APH等復制壓力誘導試劑引發(fā)復制壓力的產生,證明了復制壓力可以誘導染色體模板DNA的非隨機分離,而且癌基因誘導的DNA復制壓力(RS)也能誘導染色體模板DNA的非隨機分離,這提示誘導染色體DNA的非隨機分離與癌癥相關。進一步的數(shù)據(jù)顯示,子代細胞對染色體DNA的這種偏倚遺傳伴隨著DNA損傷反應(DDR)的不對稱分布,且這種不對稱的DNA損傷反應主要發(fā)生在端粒上。機制上,本研究發(fā)現(xiàn),ATR/CHK1信號通路在端粒DNA損傷不對稱分布介導的染色體DNA非隨機分離中起著重要作用。此外,本研究利用活細胞工作站,通過實時動態(tài)觀察到繼承母本舊DNA鏈的子細胞保持了基因組的穩(wěn)定性,而攜帶受損DNA鏈的子細胞則經歷了細胞周期停滯或細胞死亡。本團隊在損傷染色體DNA非隨機分離方面的研究,不僅為復制壓力誘導的癌細胞群的基因組穩(wěn)定性維持提供了深入了解,而且還為開發(fā)新的癌癥診斷和治療方法提供了新思路。綜上所述,本課題首次發(fā)現(xiàn)了 DNA損傷反應在有絲分裂后的不對稱分裂,這種不對稱分裂的DNA損傷反應偏好定位在端粒上,且依賴于有絲分裂期的ATR/CHK1信號通路。更為重要的是,我們發(fā)現(xiàn)DNA損傷反應的不對稱分裂促進染色體DNA非隨機分離,可能是染色體DNA非隨機分離的一個潛在機制。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R346
【圖文】：

隨后在有絲分裂期間均勻分離�；蚪M不穩(wěn)定性不僅是癌細胞的標志，更逡逑重要的是，它也是基因組疾病和癌癥易感性的原因［１］。在ＤＮＡ復制過程中發(fā)生的逡逑錯誤可能影響染色體的準確復制和有絲分裂期間的相等分離（圖１，引自Ｉｎｄｉａｎａ逡逑Ｍａｇｄａｌｏｕｅｔａｌ，２０１４）邋［２，３］。因此，復制壓力已成為基因組不穩(wěn)定的主要來源［４］。逡逑盡管如此，目前卻依然沒有統(tǒng)一清晰的描述定義復制壓力，甚至是沒有一組逡逑明確標記復制壓力的細胞標記物。實際上，復制壓力的誘因很多，或內源性（例逡逑如不適當?shù)募毎x條件）或外源性（例如暴露于ＤＮＡ損傷或復制阻斷）；作用逡逑范圍或在局部起作用（離散的暫停位點）或全局地發(fā)生在復制動力學上，并且在逡逑細胞中產生了許多影響，根據(jù)它們的來源或分子基礎來統(tǒng)一它們仍然具有挑戰(zhàn)性逡逑［５］。因此，復制壓力的定義是在不斷地發(fā)展，它涵蓋了邋ＤＮＡ復制程序中在時間和逡逑空間上受許多因素嚴格控制的各種事件，可被定義為復制叉進展和／或ＤＮＡ合成逡逑的減慢或停滯。主要包括四大類：（１）復制起點不足（缺乏或過量）；（２）分叉進逡逑展的障礙；（３）復制和轉錄之間的沖突；（４）在不適當?shù)拇x條件下的ＤＮＡ復制逡逑（不平衡的ＤＮＡ復制）［６］。逡逑１逡逑

３．１復制壓力促進染色體ＤＮＡ的非隨機分離逡逑３．邋１．邋１邋Ｐｕｌｓｅ－ｃｈａｓｅ實驗的建立與驗證逡逑我們參考經典的標記ＤＮＡ的方法之一（ｐｕｌｓｅ－ｃｈａｓｅ實驗），利用胸腺定類逡逑似物ＣｌｄＵ標記細胞ＤＮＡ兩周以上，然后在１２孔板中將細胞接種在多聚賴氨酸包逡逑被的坡上片，繼續(xù)使用含有ＣｌｄＵ的培養(yǎng)基追蹤培養(yǎng)，待細胞爬片后，冰乙醇固定，逡逑進行ＣｌｄＵ熒光染色驗證Ｕ－２０Ｓ細胞脈沖兩周后的ＤＮＡ被ＣｌｄＵ標記的情況。顯微逡逑鏡取圖并統(tǒng)計ＣｌｄＵ陽性細胞，結果顯示Ｕ－２０Ｓ細胞在ＣｌｄＵ脈沖兩周后的ＤＮＡ標逡逑記比例高大９８．邋８６％以上（圖３．邋１．邋１）。因此，我們可以采用ＣｌｄＵ脈沖兩周后的細逡逑胞進行后續(xù)的ＤＮＡ是否非隨機分布的實驗研究。逡逑ａｉｂ—逡逑

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本文編號：2718778