【摘要】：煙曲霉是在自然環(huán)境中廣泛存在的腐生菌,也是一種能感染免疫缺陷病人的條件致病真菌。由于免疫抑制劑的廣泛使用從而使得患免疫缺陷的病人數(shù)量呈不斷上升趨勢(shì),導(dǎo)致由于煙曲霉感染的侵襲性曲霉病的日益增多。目前抗真菌藥物中的唑類藥物是臨床上應(yīng)用最廣泛的一類,然而,由于唑類藥物的長(zhǎng)期和廣泛應(yīng)用又使得唑類藥物耐藥菌株大量出現(xiàn)導(dǎo)致藥效下降。在目前臨床發(fā)現(xiàn)的煙曲霉耐藥菌株中,最常見(jiàn)的是唑類藥物靶蛋白Cyp51A的突變而導(dǎo)致的,但是仍然有一些非Cyp51A突變而導(dǎo)致的耐藥株出現(xiàn),這些耐藥機(jī)制很多目前還不清楚。已有研究表明煙曲霉對(duì)于外界環(huán)境刺激而進(jìn)化的一些壓力響應(yīng)途徑,例如應(yīng)對(duì)藥物壓力刺激的途徑、宿主免疫的氧化應(yīng)激途徑等都對(duì)于它的耐藥特征和存活起了重要的作用。本研究根據(jù)煙曲霉的基因組信息,以及模式酵母中同源蛋白的功能蛋白比對(duì),選擇了兩種潛在的可能參與壓力響應(yīng)的蛋白OrmA和MtmA,利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等綜合手段整體分析了其生物學(xué)功能,具體結(jié)果歸納如下:1、闡明了OrmA通過(guò)調(diào)控鞘脂類合成從而參與唑類藥物敏感性與毒性的功能。OrmA的缺失增加了煙曲霉對(duì)唑類藥物的敏感性,通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)OrmA可以調(diào)控鞘脂的代謝。OrmA的缺失導(dǎo)致了鞘脂類神經(jīng)酰胺組分的顯著升高,而鞘脂合成抑制劑多球殼菌素能夠恢復(fù)OrmA的缺失引起的藥物敏感性增加。這些數(shù)據(jù)表明OrmA主要通過(guò)影響鞘脂類的合成從而影響了對(duì)唑類藥物的敏感性。2、OrmA的表達(dá)依賴于未折疊蛋白反應(yīng)中主要的轉(zhuǎn)錄因子HacA。OrmA不僅能夠響應(yīng)藥物刺激,而且可以響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力試劑二硫蘇糖醇(DTT)和衣霉素(TM)的刺激。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HacA的缺失導(dǎo)致OrmA的表達(dá)顯著下降,表明HacA對(duì)于OrmA的表達(dá)是非常重要的。3、小鼠肺部感染模型結(jié)果表明OrmA的缺失降低免疫缺陷小鼠的死亡率,說(shuō)明OrmA對(duì)于煙曲霉的毒性是需要的。4、證實(shí)在煙曲霉中線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MtmA對(duì)于氧化壓力應(yīng)激是必需的。煙曲霉中的mtmA是一個(gè)必需基因,通過(guò)構(gòu)建條件菌株發(fā)現(xiàn)MtmA表達(dá)的抑制對(duì)氧化壓力試劑甲萘醌和過(guò)氧化氫極度敏感主要是由于Sod2酶活的顯著下降。高表達(dá)Sod2能夠恢復(fù)由于抑制MtmA表達(dá)而導(dǎo)致的對(duì)氧化壓力的敏感,說(shuō)明MtmA可以調(diào)控由Sod2參與的抗氧化逆境。5、研究發(fā)現(xiàn)MtmA表達(dá)的抑制影響了煙曲霉胞內(nèi)Zn離子平衡,而Zn離子螯合劑TPEN能夠恢復(fù)MtmA表達(dá)的抑制引起的生長(zhǎng)缺陷。這說(shuō)明Zn離子代謝的紊亂是MtmA缺失致死的關(guān)鍵因素。6、MtmA表達(dá)的抑制顯著增加了煙曲霉對(duì)多種抗真菌藥物的耐受性。然而MtmA的低表達(dá)導(dǎo)致了與其耐藥性相矛盾的現(xiàn)象,即藥靶Erg11A/B、Erg5表達(dá)的顯著下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MtmA的低表達(dá)引起的耐藥是由于多個(gè)藥泵的高調(diào),尤其是Mdr1的顯著高調(diào)。而藥泵的高調(diào)則是由于MtmA的低表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子CrzA的持續(xù)激活。綜上所述,本文闡明了壓力響應(yīng)蛋白OrmA參與唑類藥物的耐受性,缺失導(dǎo)致藥物易感性而過(guò)表達(dá)導(dǎo)致耐藥。OrmA同時(shí)還是煙曲霉產(chǎn)生動(dòng)物毒性所必需的。煙曲霉中的mtmA是一個(gè)必需基因并參與了氧化應(yīng)激響應(yīng)、離子平衡,藥物耐受等功能。本研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步拓寬了人們對(duì)于煙曲霉中參與抗真菌藥物壓力響應(yīng)的重要蛋白的知識(shí)理解,也將可能為未來(lái)的抗真菌新藥靶發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。
【圖文】：

個(gè)煙曲霉分生孢子，雖然由免疫能力強(qiáng)的個(gè)體吸入很少會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重疾病[12, 14]。另一方面，在哮喘或囊性纖維化等肺部疾病患者中，煙曲霉感染可引起過(guò)敏性支氣管肺曲霉菌病，而在免疫功能低下的高危人群中，感染可導(dǎo)致侵襲性曲霉菌病，死亡率為 40%至 90%[15]。對(duì)侵襲性曲霉菌病最敏感的免疫缺陷人群包括白血病或基因免疫缺陷病患者和接受骨髓、造血干細(xì)胞或?qū)嶓w器官移植的患者[16-18]。煙曲霉侵染人體的過(guò)程主要如圖 1.1 所示[19]。按人體的免疫機(jī)制的啟動(dòng)順序來(lái)描述侵染過(guò)程如下，第一道防線：初吸入的煙曲霉的分生孢子會(huì)被呼吸道上皮的纖毛除去；第二道防線：較小的煙曲霉分生孢子會(huì)避開(kāi)這種防御，進(jìn)入肺呼吸道，受到肺泡巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和其他活化白細(xì)胞的進(jìn)一步攻擊。如果煙曲霉的分生孢子逃脫，它們就會(huì)發(fā)芽形成菌絲，并侵入肺和其他器官。這時(shí)，第三道防線人體的免疫機(jī)制就會(huì)觸發(fā)。到目前為止，關(guān)于煙曲霉的致病機(jī)理的研究強(qiáng)烈提示：真菌的毒性取決于各種因素，包括真菌患者的免疫狀況、真菌的生物學(xué)特征、真菌響應(yīng)外界壓力環(huán)境的生長(zhǎng)能力和應(yīng)激能力、真菌躲避免疫復(fù)合物的機(jī)理以及真菌損害宿主的能力。

真菌已經(jīng)成為人類疾病的主要原因，特別是在免疫功感染的數(shù)量增加了 207%[61, 62]。目前臨床上應(yīng)用的用靶點(diǎn)是真菌細(xì)胞膜的主要成分麥角固醇、麥角固醇主要成分β-1,3-葡聚糖、β-1,3-葡聚糖的生物合成。真固醇的功能類似物，主要功能是輔助調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性與膜結(jié)合的酶相互作用發(fā)揮功能[63]。針對(duì)細(xì)胞壁的抗真菌藥物主要有阿尼芬凈、卡泊芬凈。棘白菌素類藥物是一類廣譜性抗真菌藥物，主要作合成，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制細(xì)胞壁上的參與真菌細(xì)胞真菌的細(xì)胞壁正常的結(jié)構(gòu)，有效進(jìn)入細(xì)胞，，同時(shí)導(dǎo)致激，進(jìn)而達(dá)到抗真菌目的（圖 1.2）[1]。因?yàn)槿祟惒凰幬锏奶攸c(diǎn)之一就是毒性低，對(duì)人體的損傷小，也是抗真菌藥物。棘白菌素類藥物對(duì)念珠菌和曲霉菌有良有一定的抑菌作用，對(duì)酵母具有殺菌作用，而單單對(duì)64]。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R379

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本文編號(hào)：2708120