【摘要】：多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病,目前對MS治療的主要機制是抑制急性期炎性脫髓鞘病變進展,并非直接促進髓鞘修復(fù),大部分的藥物都是作用于免疫系統(tǒng),通過免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)起作用。越來越多的觀點認為,促進髓鞘再生誘導(dǎo)修復(fù)和增強神經(jīng)保護作用可以作為MS免疫調(diào)節(jié)治療的補充,這可以更好的促進疾病的自然修復(fù)。消旋-3-正丁基苯酞(DL-3-n-butylphthalide,NBP)是一種人工合成的消旋體,被證實能通過改善線粒體功能從而影響神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞的生長和凋亡,但是該藥對少突膠質(zhì)細胞和脫髓鞘的作用尚不明確。前期我們研究顯示NBP可以改善脫髓鞘患者的癥狀及減輕腦磁共振的白質(zhì)脫髓鞘病灶,并且在溴化乙錠脫髓鞘大鼠模型中顯示出抗細胞凋亡作用,但機制尚不明確。雙環(huán)己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)脫髓鞘小鼠模型是MS研究常用的動物模型,其以損傷線粒體功能導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞凋亡為特征,由于CPZ喂養(yǎng)可誘導(dǎo)小鼠可逆性脫髓鞘,更適合用于髓鞘脫失和再生機制的研究。因此,本研究擬在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建CPZ脫髓鞘小鼠模型,采用NBP進行治療,探索其治療的效果和可能作用機制,為臨床治療MS提供新的候選藥物。第一部分CPZ脫髓鞘小鼠模型建立和NBP對脫髓鞘模型的行為學(xué)和髓鞘的影響目的:構(gòu)建CPZ脫髓鞘小鼠模型,研究NBP對脫髓鞘小鼠的行為學(xué)影響和觀察NBP治療后髓鞘和軸突的變化。方法:取6-7周齡C57BL/6雄性小鼠,體重在15-16g之間,按不同實驗?zāi)康姆譃槟Ｐ徒⒉糠趾退幬镄袨閷W(xué)觀察和機制研究部分:(1)模型建立部分:分為正常組3只,CPZ模型組15只,共18只。正常組每天喂養(yǎng)普通飼料,CPZ模型組每天喂養(yǎng)含有0.2%CPZ的混合鼠糧;CPZ模型鼠從喂養(yǎng)鼠糧開始每隔一周心臟灌注取材,從第1周末開始,每周3只灌注取材,連續(xù)5周,第5周末結(jié)束(分別為CPZ1周組,CPZ2周組,CPZ3周組,CPZ4周組,CPZ5周組);(2)NBP藥物行為學(xué)觀察和機制研究部分:分別為對照組,CPZ模型組,10mg/kg NBP+CPZ治療組,20mg/kg NBP+CPZ治療組,每組10只,共40只。對照組每天喂養(yǎng)普通飼料,模型組和治療組每天喂養(yǎng)含有0.2%CPZ的混合飼料,在第2周開始各濃度NBP組每天按小鼠體重腹腔注射NBP 1次,對照組和CPZ模型組腹腔注射0.9%生理鹽水0.1毫升,于每周末稱量體重變化直至第5周末,各組均在第5周末取材。造模第四周末,利用Morris水迷宮測試對各組小鼠進行學(xué)習(xí)記憶能力檢測,第5周開始,旋轉(zhuǎn)棒實驗和曠場實驗觀察小鼠平衡和運動功能,利用LFB髓鞘染色和NF68免疫組織化學(xué)染色觀察胼胝體區(qū)域髓鞘和軸突變化,透射電鏡觀察各組超微結(jié)構(gòu),WB檢測各組髓鞘蛋白PLP和MBP的表達水平。結(jié)果:1.與對照組相比,隨著時間延長,同期CPZ模型小鼠體重明顯下降(P0.05),NBP腹腔注射4周后能夠緩解CPZ小鼠體重的下降(P _10.01,P _20.01)。2.旋轉(zhuǎn)棒實驗發(fā)現(xiàn)第5周CPZ模型小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間明顯減少,平衡功能明顯落后于對照組小鼠(P0.05)。而與模型組比較,兩種不同濃度的NBP組均可以增加小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間(P _10.05,P _20.05)。曠場實驗研究發(fā)現(xiàn),4個組小鼠的移動速度和總路程均無明顯差異(P0.05)。水迷宮實驗研究表明,前5日各組小鼠逃避潛伏期均逐日下降,但在第6日4個組小鼠在目標(biāo)象限累計距離和穿越平臺次數(shù)均無明顯差異(P0.05)。3.LFB髓鞘染色與對照組比較,CPZ模型小鼠胼胝體在第2周時開始出現(xiàn)髓鞘脫失(P0.05),在第4周時髓鞘脫失更加顯著,第5周時髓鞘脫失基本完畢(P0.05),形成急性脫髓鞘模型。第5周末與CPZ模型組比較,兩種濃度NBP治療組均可改善CPZ模型小鼠胼胝體脫髓鞘程度并與藥物濃度存在關(guān)聯(lián)性(P _10.001,P _20.001),高濃度NBP比低濃度NBP更有效減輕脫髓鞘(P0.001)。4.電鏡結(jié)果提示CPZ模型小鼠胼胝體存在髓鞘超微結(jié)構(gòu)破壞和軸突線粒體損傷,NBP治療后可以促進髓鞘板層結(jié)構(gòu)完整性,保護軸突線粒體。5.與對照組相比,CPZ模型組胼胝體的髓鞘蛋白PLP和MBP表達顯著減少(分別為P0.05和P0.01),20mg/kg NBP治療與模型組相比能夠有效促進這兩種髓鞘蛋白的生成(分別為P0.05和P0.01)。6.CPZ模型組小鼠胼胝體中NF68免疫組化陽性染色不連續(xù),排列紊亂,表達較對照組顯著下降(P0.001)。經(jīng)過4周的NBP治療后,低濃度和高濃度NBP組NF68的表達與模型組相比均有明顯升高(P _10.001,P _20.001),且高濃度NBP組NF68表達的升高比低濃度NBP組更顯著(P0.05)。結(jié)論:1.CPZ模型小鼠出現(xiàn)體重下降和平衡功能障礙,而NBP能夠改善CPZ脫髓鞘小鼠的體重和平衡障礙。2.CPZ模型小鼠的髓鞘隨時間延長逐漸脫失,第5周時髓鞘完全脫失,NBP治療后可改善脫髓鞘并與濃度有相關(guān)性。3.高濃度的NBP通過促進髓磷脂蛋白質(zhì)PLP和MBP的生成從而減輕CPZ模型小鼠中的髓鞘脫失。4.CPZ脫髓鞘小鼠存在軸突及線粒體損傷,NBP可以保護線粒體結(jié)構(gòu)完整性,減輕軸突損傷。第二部分NBP抑制NF-κB信號通路活化減輕炎癥反應(yīng)目的:采用CPZ脫髓鞘小鼠模型,研究CPZ模型小鼠炎癥細胞浸潤變化及NBP對脫髓鞘小鼠的炎癥浸潤影響,并進一步探討NBP對NF-κB信號通路活化的影響。方法:實驗動物和分組同第一部分。采用HE染色和GFAP、Ibal-1免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記并觀察各組胼胝體區(qū)域炎性細胞浸潤、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的變化,WB檢測各組NF-κB(p65)、IκBα、TNF-α蛋白的表達水平。結(jié)果:1.與對照組比較,CPZ脫髓鞘小鼠胼胝體隨著時間延長炎性細胞浸潤逐漸加重,在第4、5周時炎性浸潤明顯達到高峰(P0.05),第5周時CPZ組星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞明顯增生活化(分別為P0.001和P0.001)。2.與CPZ模型組比較,NBP治療4周后能夠減輕小鼠胼胝體炎性細胞浸潤程度(P _10.001,P _20.001),同時能夠抑制星形膠質(zhì)細胞異常增生(P _10.001,P _20.001)和小膠質(zhì)細胞的活化(P _10.001,P _20.001)并與藥物濃度存在關(guān)聯(lián)性,高濃度NBP抑制效果較低濃度NBP更顯著(P0.01)。3.與對照組比較,CPZ模型組促進了胼胝體IκBα降解(P0.001)、NF-κB(p65)核易位(P0.001)以及促炎癥細胞因子TNF-α的釋放(P0.01)。NBP治療后均可抑制NF-κB(p65)核移位(P _10.05,P_20.001),減輕IκBα的降解(P _10.05,P_20.001),降低CPZ小鼠中的TNF-α水平(P_10.05,P_20.01),但是高濃度的NBP的抑制效果較低濃度的NBP更顯著(P0.05)。結(jié)論:1.CPZ模型小鼠的炎性細胞浸潤隨時間延長逐漸增加,NBP治療后可減輕炎性細胞浸潤并抑制模型組中星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增生活化。2.NBP通過抑制NF-κB信號通路活化和TNF-α的表達從而抑制炎癥反應(yīng)。第三部分NBP抑制線粒體凋亡信號通路保護少突膠質(zhì)細胞目的:采用CPZ脫髓鞘小鼠模型,研究CPZ模型小鼠少突膠質(zhì)細胞(Oligodendrocyte,OL)和少突膠質(zhì)前體細胞(Oligodendrocyte precursor cell,OPC)變化及NBP對脫髓鞘小鼠少突膠質(zhì)細胞譜系的影響。方法:實驗動物和分組同第一部分。采用CC1、NG2、Olig2免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記并觀察各組OL和OPC的變化,Tunel+CC1免疫熒光染色檢測各組OL凋亡情況,WB檢測線粒體途徑相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C、Cleaved Caspase-3水平。結(jié)果:1.與對照組相比,CPZ模型組胼胝體CC1標(biāo)記的OL從第2周開始數(shù)量逐漸減少(P0.05),在第4周達最低值(P0.05),之后在第5周末OL數(shù)量明顯增多(P0.05)。同時,胼胝體NG2標(biāo)記的OPC從第2周開始增多,第5周末數(shù)量則達到高峰。2.在第5周末,NBP組OL數(shù)量相比模型組明顯減少(P _10.001,P _20.001)。模型組第三腦室室管膜下區(qū)存在OL凋亡,與模型組相比,高濃度的NBP組通過降低Bax/Bcl-2(P0.01)、Cyt C(P0.01)、Cleaved Caspase-3(P0.05)蛋白表達減少OL的凋亡(P0.05)。3.在第5周時CPZ組胼胝體OPC數(shù)量較對照組明顯增加(P0.001),與CPZ組比較,NBP組OPC數(shù)量顯著下降(P _10.001,P _20.001)。另外模型組Olig2陽性表達較對照組表達明顯增多(P0.01),NBP組Olig2表達相比模型組顯著減少(P _10.01,P _20.001)。結(jié)論:1.在喂養(yǎng)CPZ鼠糧2-4周,CPZ模型組胼胝體存在OL的丟失及OPC增殖和遷移,而在第5周末OPC增殖達到高峰并分化為成熟的OL。2.喂養(yǎng)CPZ鼠糧5周仍有OL凋亡,而高濃度的NBP通過抑制Bax/Bcl-2、CytC和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平減輕OL凋亡。全文結(jié)論本研究采用CPZ脫髓鞘小鼠模型、通過行為學(xué)測試結(jié)合各種分子生物學(xué)研究方法,探討NBP在脫髓鞘疾病中的治療作用和可能作用機制,開發(fā)NBP新的用途。研究結(jié)果顯示:1.NBP可以減輕CPZ脫髓鞘小鼠的髓鞘脫失和軸突損傷;2.NBP通過抑制NF-κB信號通路活化減輕炎癥反應(yīng);3.NBP抑制線粒體凋亡信號通路的啟動從而保護OL。NBP在脫髓鞘疾病中通過抗炎和增強神經(jīng)保護作用促進髓鞘的修復(fù)。
【圖文】：

28石蠟切片制作：從前囟往后 1.6-2.2mm 以冠狀方向切割腦組織。raffin section method of brain：The brain tissue was cut in a coronal direction mm.標(biāo)本制作在第 5 周小鼠完成行為學(xué)測試后，使用 5%的水合氯醛，，此后，暴露小鼠胸腔和心臟，使用 0.9%生理鹽水灌待右心耳流出清亮液體后再切換成預(yù)冷的 4%多聚甲醛液心臟灌注，待小鼠四肢和尾巴變硬后斷頭取腦。小心解剖分離小鼠的胼胝體組織，選取 1mm3大小的組本，快速放入 2.5%的戊二醛浸泡，并放置于 4℃冰箱內(nèi)固

苯酞對 Cuprizone 誘導(dǎo)的急性脫髓鞘小鼠模型的作用及機制研究 博 組比較 P 值，P2為 20mg/kg NBP+CPZ 組與 CPZ 組比同），結(jié)果見表 1-3、圖 1-2。表 1-3 各組之間體重比較初始體重 1 周 2 周 3 周 4 周 16.13±0.54 17.19±0.49 17.76±0.31 18.24+0.45 18.93±0.46 16.05±0.54 15.41±0.67 15.65±0.73 15.94±0.71 16.15±0.73 組 16.21±0.45 15.28±0.33 15.64±0.32 16.12±0.41 16.52±0.49 組 15.91±0.53 15.41±0.73 15.75±0.68 16.22±0.61 16.73±0.54
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R744.51;R-332

【參考文獻】

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