本文關鍵詞：B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究相關單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae, Hi)是一類可以引起嬰幼兒呼吸道感染進而會引起繼發(fā)性疾病的病原菌。根據(jù)其有無莢膜,可分為有莢膜型和無莢膜型。無莢膜型細菌通常引起成人和兒童的局部感染；有莢膜型細菌可以引起較為嚴重的侵襲性感染。根據(jù)其細菌表面莢膜多糖的成分和抗原性的不同,有莢膜型細菌又可以分為a、b、c、d、e、f六種血清型,不能分型者稱為不定型型。其中,B型流感嗜血桿菌(Hib)的致病力最強,它可以引起敗血癥,并由此引發(fā)腦膜炎、肺炎、會厭炎、蜂窩組織炎、心包炎和中耳炎等。Hib的感染對象主要是5歲以下的小兒,尤其是2歲以下的嬰幼兒。目前,對于Hib感染的主要治療是依靠抗生素。然而,近年來隨著細菌耐藥性的增加,特別是多重耐藥性菌株的出現(xiàn),采用疫苗預防Hib變得十分必要,因此該策略受到越來越多的重視。如今已有多種疫苗用于Hib的預防并且成效顯著,但它們也存在一定的缺點,譬如價格昂貴且疫苗的質(zhì)量和安全性難以控制等。與此同時,能夠?qū)ib感染進行早期檢測,以便給予及時的處理,對于實施有效的治療、防止Hib的擴散及降低由感染引發(fā)的后遺癥都是非常必要和有重要意義的,但是目前還缺乏特別有效的Hib檢測方法。古巴科學家采用化學合成的方法制備獲得了Hib細菌莢膜多糖的寡糖片段,并成功地將其應用研制新型的半合成Hib疫苗,證實具有良好的免疫效果,該疫苗已經(jīng)在臨床上得到廣泛應用。這一研究表明了化學方法制備的具有單一結(jié)構、質(zhì)量明確、安全性優(yōu)良的寡糖抗原用于研發(fā)疫苗的可能性。此外,隨著單克隆抗體技術的不斷成熟及其在各個領域的廣泛應用,如今以此技術為基礎研發(fā)特異、高效的單克隆抗體檢測試劑這一領域得到飛速發(fā)展,這為我們發(fā)展可以實現(xiàn)Hib感染早期檢測的單克隆抗體試劑盒提供了可能。本課題的終極目標是研發(fā)針對Hib的新型糖疫苗,同時研發(fā)可用于Hib細菌診斷的單克隆抗體。為此,本課題組先后合成了以Hib的細菌莢膜多糖,即多聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)的重復片段為基礎的七(Hept).九(Nona)和十一(Undeca)聚糖,并將它們與作為載體蛋白的血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶合,形成糖蛋白結(jié)合疫苗Hept-KLH、Nona-KLH和Undeca-KLH。本論文對這些糖蛋白結(jié)合疫苗進行了全面的免疫學評價,并檢測了其抗血清與Hib10211菌株的結(jié)合力。同時,還用這些糖蛋白結(jié)合疫苗免疫小鼠,通過單克隆抗體技術制備獲得了針對Hib表面莢膜寡聚糖的單克隆抗體,鑒定了該單克隆抗體的亞型,并在體外檢測了單克隆抗體識別和殺傷Hib細菌的能力。試驗結(jié)果表明,合成的三種糖綴合物中,Nona-KLH的免疫效果較其它兩種糖綴合物強,經(jīng)過四次免疫之后,小鼠產(chǎn)生了很高的抗體滴度,特別是具有保護作用的IgG1免疫球蛋白,以及T細胞依賴型的免疫反應�？寡迮cHib細菌的結(jié)合試驗顯示,抗血清可以與Hib10211細菌進行特異性結(jié)合。用Nona-KLH對小鼠進行免疫后,通過單克隆抗體技術制備獲得了一種抗原特異性的單克隆抗體,對其進行抗體亞型分析以及SDS-PAGE、Western blot等分析的結(jié)果均顯示該抗體為IgM亞型。體外殺菌實驗表明,在補體存在的條件下,該單克隆抗體可以介導明顯的補體依賴型“殺菌”效果。本研究證實了合成的多聚核糖基核糖醇磷酸酯重復片段的寡聚體與載體蛋白所形成的綴合物可以誘導有效的免疫反應,從而為研發(fā)新型的Hib糖疫苗提供了思路與方法；同時,所獲得的可有效識別Hib細菌的單克隆抗體有可能為Hib感染的早期診斷提供新的手段。
【關鍵詞】：B型流感嗜血桿菌 合成疫苗 免疫反應 單克隆抗體 殺菌能力
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 符號說明11-13
• 第一章 緒論13-26
• 1.1 糖13-14
• 1.2 糖藥物14-15
• 1.3 糖疫苗15-16
• 1.4 糖疫苗的免疫機理16-17
• 1.5 Hib病原學17-18
• 1.6 Hib流行病學特點18-19
• 1.7 Hib疫苗的發(fā)展19-21
• 1.7.1 Hib莢膜多糖疫苗19-20
• 1.7.2 Hib結(jié)合疫苗20-21
• 1.7.2.1 PRP-D結(jié)合疫苗20
• 1.7.2.2 Hb-OC結(jié)合疫苗20-21
• 1.7.2.3 PRP-OMP結(jié)合疫苗21
• 1.7.2.4 PRP-T結(jié)合疫苗21
• 1.8 其他Hib疫苗的發(fā)展21-22
• 1.9 單克隆抗體技術22-23
• 1.10 單克隆抗體的應用23-24
• 1.11 本研究的目的和意義24-26
• 第二章 半合成Hib糖結(jié)合疫苗的免疫學評價26-40
• 2.1 引言26-27
• 2.2 材料27-30
• 2.2.1 細菌菌株,疫苗,小鼠27
• 2.2.2 主要試劑以及耗材27
• 2.2.3 主要儀器27-28
• 2.2.4 主要試劑的配制28-30
• 2.2.4.1 Elisa相關試劑的配制28-29
• 2.2.4.2 Hib細菌培養(yǎng)的相關試劑29-30
• 2.3 實驗方法30-33
• 2.3.1 流感嗜血桿菌糖蛋白疫苗的合成30
• 2.3.2 動物免疫30
• 2.3.3 Elisa法檢測血清中抗體滴度30-31
• 2.3.4 Hib細菌的培養(yǎng)31
• 2.3.5 Hib細菌的鑒定31-32
• 2.3.5.1 革蘭氏染色31-32
• 2.3.5.2 生化檢定32
• 2.3.5.3 生長因子檢定32
• 2.3.6 Hib細菌菌庫的建立32
• 2.3.7 Hib生長曲線的測定32-33
• 2.3.8 抗血清與細菌的結(jié)合能力檢測33
• 2.4 結(jié)果與討論33-38
• 2.4.1 疫苗的免疫效果33-34
• 2.4.2 Hib細菌的培養(yǎng)結(jié)果34-35
• 2.4.3 Hib細菌的鑒定35-37
• 2.4.3.1 革蘭氏染色結(jié)果35-36
• 2.4.3.2 生化檢定結(jié)果36
• 2.4.3.3 生長因子檢定實驗36-37
• 2.4.3.4 Hib細菌生長曲線的測定37
• 2.4.4 抗血清與細菌的結(jié)合實驗37-38
• 2.5 小結(jié)38-40
• 第三章 單克隆抗體的制備以及體外殺菌活性研究40-60
• 3.1 引言40
• 3.2 實驗材料40-43
• 3.2.1 實驗細胞及動物40
• 3.2.2 試驗試劑及耗材40-41
• 3.2.3 主要儀器及其型號41
• 3.2.4 主要試劑的配制41-43
• 3.2.4.1 細胞培養(yǎng)相關試劑的配制41
• 3.2.4.2 SDS-PAGE緩沖液41-43
• 3.2.4.3 Western blot相關試劑配制43
• 3.2.4.4 多聚賴氨酸溶液配制43
• 3.3 實驗方法43-51
• 3.3.1 小鼠骨髓瘤細胞的培養(yǎng)43-45
• 3.3.1.1 細胞的凍存43-44
• 3.3.1.2 細胞復蘇44
• 3.3.1.3 細胞傳代44
• 3.3.1.4 細胞收集與計數(shù)44-45
• 3.3.2 單克隆抗體的制備45-47
• 3.3.2.1 加強免疫45
• 3.3.2.2 脾細胞的制備45
• 3.3.2.3 小鼠骨髓瘤細胞的準備45-46
• 3.3.2.4 細胞融合46
• 3.3.2.5 雜交瘤細胞的篩選46-47
• 3.3.2.6 雜交瘤細胞的克隆化47
• 3.3.3 雜交瘤細胞的染色體分析47-48
• 3.3.4 單克隆抗體分型試劑盒檢測所得單克隆抗體的亞型48
• 3.3.4.1 樣品準備與處理48
• 3.3.4.2 抗體分型檢測48
• 3.3.5 單克隆抗體的大量制備48-49
• 3.3.6 單克隆抗體抗體亞型的驗證49-50
• 3.3.6.1 SDS-PAGE檢測49
• 3.3.6.2 Western blot49-50
• 3.3.7 單克隆抗體的“殺菌力”實驗50-51
• 3.3.7.1 細菌菌落形成單位(CFU)的確定50
• 3.3.7.2 腹水中IgM“殺菌”力實驗50-51
• 3.4 實驗結(jié)果與討論51-59
• 3.4.1 制備單克隆抗體的實驗結(jié)果51-52
• 3.4.2 雜交瘤細胞染色體分析結(jié)果52-53
• 3.4.3 單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果53-54
• 3.4.4 大量制備單克隆抗體結(jié)果54
• 3.4.5 單克隆抗體抗體亞型的驗證結(jié)果54-59
• 3.4.5.1 SDS-PAGE實驗結(jié)果54-55
• 3.4.5.2 Western blot實驗結(jié)果55-57
• 3.4.5.3 細菌菌落形成單位(CFU)的確定57
• 3.4.5.4 腹水中IgM抗體的“殺菌”活性57-59
• 3.5 小結(jié)59-60
• 全文總結(jié)60-62
• 參考文獻62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學位論文68-69
• 學位論文評閱及答辯情況表69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鐘細茍,段載金,康治雄;豬瘟單克隆抗體診斷技術的推廣應用[J];中國獸醫(yī)科技;1999年12期

  本文關鍵詞：B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究相關單克隆抗體的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270593