【摘要】：人胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)是分離自人囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),具有自我更新和多向分化的潛能[1]。hESCs生長在滅活的小鼠成纖維細(xì)胞(即飼養(yǎng)層)上,培養(yǎng)基里需要添加血清替代物(Knockout Serum Reβlacement,KSR)和多種細(xì)胞因子(如ActivinA和bFGF等),但是在此條件下培養(yǎng)的hESCs生長速度十分的緩慢,不能耐受單細(xì)胞消化,容易凋亡[2]。雖然市場上出現(xiàn)了商品化的Matrigel可以部分的替代飼養(yǎng)層細(xì)胞,但是培養(yǎng)在Matrigel上的hESCs同樣存在易分化和易凋亡等缺點(diǎn),而且Matrigel操作麻煩,價(jià)格也相對比較的高。因此,尋找hESCs的新的培養(yǎng)方法已成為當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)研究方向之一。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制劑IWR1可以改善目前hESCs培養(yǎng)的狀況。IWR1是Tankyrases的一個(gè)抑制劑,Tankyrases的功能主要就是促進(jìn)Axin蛋白的降解,Axin蛋白是β-catenin降解復(fù)合物的主要組成成分,所以小分子IWR1處理過的細(xì)胞可以穩(wěn)定Axin蛋白從而降解β-catenin。雖然抑制Wnt/β-catenin信號通路可以促進(jìn)hESCs的自我更新[3],但是具體的作用機(jī)制還不清楚。所以就得到了我所研究的課題:探究IWR1維持hESCs自我更新的分子機(jī)制。因?yàn)橐种芖nt/β-catenin信號通路可以促進(jìn)hESCs的自我更新,所以我們就利用逆向思維來研究W nt/β-catenin信號通路是如何促進(jìn)了hESCs分化,從而解析出IWR1維持hESCs自我更新的分子機(jī)制。本課題主要分為以下幾個(gè)部分:第一部分:以前的文獻(xiàn)報(bào)道過,β-catenin的過表達(dá)快速導(dǎo)致hESC分化[4]。因此,我們要首先需要確定β-catenin的這一功能。用PiggyBac載體(PB-Ctnnb1)使Ctnnb1在hESCs細(xì)胞株中的表達(dá)量提高。其中Ctnnb1在密碼子33處含有激活突變(S33Y:即當(dāng)33位的絲氨酸(S)突變成酪氨酸(Y),導(dǎo)致β-catenin不能被磷酸化降解,從而穩(wěn)定其在細(xì)胞內(nèi)的含量)。在添加了ActivinA/bFGFF/IWR1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天之后,PB-Ctnnb1S33Y細(xì)胞中與分化相關(guān)的基因Cxcr4,FoxA 和Mixl1的表達(dá)含量顯著升高,然而轉(zhuǎn)有空載PB的對照細(xì)胞仍保留傳統(tǒng)的hESCs形態(tài),處于自我更新的狀態(tài)。比如具有堿性磷酸酶染色的活性,高表達(dá)與多能性相關(guān)的基因Oct4,Nanog和TRA1-81。這些結(jié)果表明Ctnnb1的過表達(dá)不利于hESCs的自我更新。因此,我們確定Ctnnb1的過表達(dá)能夠促進(jìn)hESCs分化。第二部分:為了驗(yàn)證Ctnnb1是否通過其轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)hESCs分化,基于Ctnnb1S33Y基因的特定結(jié)構(gòu)域,設(shè)計(jì)了一系列的缺失突變體[5-6]。Ctnnb1蛋白由781個(gè)氨基酸組成,基于此,我們做了以下幾個(gè)突變體:Ctnnb1S33Y/△N48-217:Ctnnb1蛋白缺失N端第48到217的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△N218-467:Ctnnb1蛋白缺失N端第218到467的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△C468:Ctnnb1蛋白缺失C端第468到781的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△C694:Ctnnb1蛋白缺失C端第694到781的氨基酸。將這些突變體形式的Ctnnb1插入PB質(zhì)粒中并在hESCs中成功過表達(dá)。將其在添加了Activin/bFGF/IWR1的培養(yǎng)基中傳代2次之后,進(jìn)行了一系列的功能性驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)Cnnb1S33Y和Ctnnb1S33Y/△N48-217誘導(dǎo)hESCs分化。PB和Ctnnb1S33Y/△N218-467細(xì)胞中大多數(shù)hESCs仍然保持多能性。TOPFlash報(bào)告基因活性的結(jié)果顯示,Ctnnb1S33Y和Ctnnb1S33Y/△N48-217強(qiáng)烈激活TCF依賴性轉(zhuǎn)錄,但是S33Y突變對TCF轉(zhuǎn)錄的影響在很大程度上由于某些Ctnnb1結(jié)構(gòu)域的缺失而消除,例如C末端(S33Y/△C468和C694)或armadillo repeats 3-8(S33Y/△N218-467)。因此,我們的數(shù)據(jù)與之前的模型一致,其中Ctnnb1通過armadillo repeats 3-8與TCF結(jié)合并通過其C-末端激活轉(zhuǎn)錄[33],并且還表明Ctnnb1主要通過與LEF1/TCF家庭成員相互作用誘導(dǎo)hESCs分化。第三部分:LEF1/TCF家族轉(zhuǎn)錄因子含有四個(gè)旁系同源物(LEF1,TCF1,TCF3和TCF4),并且都能夠與Ctnnb1相互作用[7]。為了確定Ctnnb1主要與LEF1/TCF家族中哪個(gè)基因相互作用誘導(dǎo)hESCs分化。我們在hESCs中分別過表達(dá)TCF因子,發(fā)現(xiàn)只有Tcf1過表達(dá)會導(dǎo)致hESCs明顯的分化。與PB對照細(xì)胞相比,Tcf1過表達(dá)的hESCs細(xì)胞變得扁平,失去活性并且多能性基因Oct4和Nanog的表達(dá)水平較低,同時(shí)顯示分化基因的表達(dá)增強(qiáng),例如內(nèi)胚層(Gata4和Gata6),中胚層(T和Mixl1)和外胚層(Fgf5)等標(biāo)志基因。與此一致,免疫熒光染色顯示大多數(shù)過表達(dá)Tcf1基因的細(xì)胞中GATA6表達(dá)呈陽性。這些結(jié)果表明Ctnnb1主要通過與Tcf1相互作用誘導(dǎo)hESCs分化。最后,為了確定Tcf1誘導(dǎo)hESCs分化的機(jī)制,我們對PB和PB-TCF1的hESCs進(jìn)行了RNA-Seq分析來評估基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示GATA6的表達(dá)顯著升高。所以我們在過表達(dá)TCF1的細(xì)胞株中敲低Gata6了轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)過免疫熒光染色及qRT-PCR分析結(jié)果顯示:與僅過表達(dá)TCF1的對照組細(xì)胞相比,過表達(dá)TCF1且同時(shí)敲低Gata6基因的hESCs中高表達(dá)自我更新標(biāo)志基因Oct4和Nanog,而低表達(dá)分化基因Gata4,Gata6,FoxA2。這些結(jié)果表明GATA6可以調(diào)控Tcf1在hESCs中的功能。綜上所述,本課題通過逆向思維,研究Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)hESCs分化,進(jìn)而解析了IWR1抑制Wnt/β-catenin信號通路維持人胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制,即IWR1抑制Wnt/β-catenin信號通路后,阻止了β-catenin與TCF1的相互作用,從而抑制了分化基因Gata6的表達(dá),從而維持hESCs在未分化狀態(tài)。研究結(jié)果擴(kuò)大了人們對hESCs自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。
【圖文】：

圖１．２邋Ｃｔｎｎｂｉ敲低的ｈＥＳＣｓ能夠維持未分化狀態(tài)逡逑（Ａ）邐ｑＲＴ－ＰＣＲ分析在添加ＡｃｔｉｖｉｎＡ，邋ｂｌ＾ＧＦ和ＩＷＲ１的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)７ｗ＾／ｓｈＲＮＡｈＥＳＣｓ中ｈＥＳＣｓ多能性標(biāo)志物（（９ｃ／？＾和」＼＾／７0尺）表達(dá)。相對于逡逑ｍｂｌｅ邋ｓｈＲＮＡ，邋＊＊ｐ邋＜０．０１。逡逑

ＱｗｊＷ邋ｋｏ邋ｈＥＳＣｓ在長期培養(yǎng)一段時(shí)間后，仍然保留了典型的未分化ＥＳＣ逡逑形態(tài)，并且經(jīng)過免疫熒光染色（ＩＦ）后，多能性基因ＯＣ７Ｖ表達(dá)染色呈陽性（圖逡逑１．３Ｃ），此結(jié)果，與敲低的細(xì)胞株結(jié)果類似（圖１．２Ａ和Ｂ）�？傊�，這些逡逑結(jié)果表明敲除的ｈＥＳＣｓ能夠維持未分化狀態(tài)。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｃｔｎｎｂｌ邋ＣＤＳ邋ｆｒｏｍ邋６１邋ｔｏ邋７８ｂｐ邐ｃｔｎｎｂｉ邋ｗｔ邋ｋｏ逡逑Ｗｉｌｄ邋Ｔｙｐｅ：邋ＣＴ邋ＧＴＴＡＧ邋ＴＣＡＣＴ邋ＧＧＣＡＧＣ邐ＣＴＮＮＢ１逡逑Ｋｎｏｃ＾ＣＴＧＴＴＡＧ＾ＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣ邐0側(cè)一壽逡逑Ｃ邐ＣＴＮＮＢ１１邋０ＣＴ４邋Ｈｏｅｃｈｓｔ邋ＣＴＮＮＢＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑｜~|媝■曑逡逑畫■■■■逡逑圖１．３邋Ｃｔｎｎｂｌ敲除的ｈＥＳＣｓ能夠維持未分化狀態(tài)逡逑（Ａ邋，邋Ｂ邋）通過ＨＥＳ２邋ＥＳＣ中的基因組ＤＮＡ測序和蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證逡逑ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９對Ｃ融Ｗ的敲除。逡逑（Ｃ）在邋ｍＴｅＳＲ邋中培養(yǎng)邋１０邋代的邋Ｃ／ｗｊＷ－？Ｍ／／ｈＥＳＣｓ邋中的邋ＣＴＡＷ５／邋和邋ＯＣ７Ｖ邋的免逡逑疫染色。ＰＢ：邋ＰｉｇｇｙＢａｃ，邋ＣＶｗ？Ａ／：邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ，邋ＷＴ：野生型。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物逡逑重復(fù)的平均值±ｓ．ｄ。比例尺，，１００ｐｍ。逡逑３．２邐需要其轉(zhuǎn)錄活性來誘導(dǎo)ｈＥＳＣｓ分化逡逑３．２．１邋ＣＹ＂／}?／突變體過表達(dá)的ｈＥＳＣｓ細(xì)胞株的建立逡逑為了驗(yàn)證是否通過其轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)ｈＥＳＣｓ分化，基于’基逡逑因的特定結(jié)構(gòu)域，設(shè)計(jì)了一系列的缺失突變體｜５，６１邋（圖２．１Ａ）。７８１個(gè)氨基酸組逡逑成的Ｃ／Ｗ７／）／蛋白是重要的轉(zhuǎn)錄反式激活因子［７］。基于此
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R321

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張濤;;基于組織自我更新策略的學(xué)校文化發(fā)展路徑[J];中國教師;2011年01期

2 徐秀英;龐紅威;柳麗榮;尚雅珍;李宏蓮;;試論學(xué)校升格后中專教師自我更新的基本路徑[J];隴東學(xué)院學(xué)報(bào);2015年03期

3 紫荊;;今天的你并非是昨天的你[J];風(fēng)流一代;2017年35期

4 王玉萍;;論教師自我更新的機(jī)制[J];科技信息(學(xué)術(shù)研究);2006年11期

5 肖志華;;把創(chuàng)新變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)[J];企業(yè)家天地;2006年02期

6 加里·哈美爾 ,何蔚;把創(chuàng)新變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)[J];通信企業(yè)管理;2004年05期

7 劉愛敏;21世紀(jì)圖書館文獻(xiàn)信息人員的自我更新勢在必行[J];引進(jìn)與咨詢;2004年11期

8 黃偉莉 ,余英 ,彭利軍;教師的自我更新[J];江西教育科研;2004年12期

9 白益民;教師的自我更新:背景、機(jī)制與建議[J];華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(教育科學(xué)版);2002年04期

10 魏磊;論企業(yè)的市場決勝法則──自我更新[J];經(jīng)濟(jì)體制改革;1998年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李芳菲;王亞平;;胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制[A];中國解剖學(xué)會第八屆組織學(xué)與胚胎學(xué)專業(yè)青年研討會論文集[C];2004年

2 宋獻(xiàn)民;袁有忠;沈紅梅;俞■;徐鋒;Huang Paulina;Shields Donna;程濤;王健民;;HOXB4調(diào)控造血干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[A];第10屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2005年

3 張吉敏;;與茶結(jié)緣悟茶道——探少兒茶藝開展的意義[A];“大禹]罕比俁枰昭刑只狒呱俁枰昭肴募痆C];2006年

4 李南;張萌萌;;“自我更新”取向視角下的高校輔導(dǎo)員幸福觀研究[A];2011年全國高校學(xué)生工作年會論文集[C];2011年

5 龐全海;馬勇江;張慧茹;華進(jìn)聯(lián);楊學(xué)義;竇忠英;;造血干細(xì)胞研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[A];全國首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

6 黃志雄;張雙玲;吳磊;陳丹;王萍;宋世震;江高峰;;低劑量鎘模擬雌激素樣作用誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮干細(xì)胞自我更新和增殖[A];中國毒理學(xué)會第六屆全國毒理學(xué)大會論文摘要[C];2013年

7 黃鷺;;土家吊腳樓聚落自我更新研究——以恩施宣恩彭家寨為例[A];中國民族建筑研究會第二十屆學(xué)術(shù)年會論文特輯（2017）[C];2017年

8 朱妮;王華芳;王斌生;付珊;韋潔平;單威;黃河;;NR2F2參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和多能分化的干性維持[A];2015年浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2015年

9 王進(jìn)芬;;列寧關(guān)于黨內(nèi)民主功能的重要認(rèn)識[A];中國國際共運(yùn)史學(xué)會2012年年會暨學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

10 劉起東;康九紅;;胚胎干細(xì)胞干性維持和DNA損傷修復(fù)的新發(fā)現(xiàn)[A];中國解剖學(xué)會2015年年會論文文摘匯編[C];2015年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 北京電影學(xué)院教授 杜慶春;“星戰(zhàn)”系列能否實(shí)現(xiàn)自我更新？[N];文匯報(bào);2018年

2 管璇悅;微創(chuàng)新，助教育自我更新[N];貴陽日報(bào);2018年

3 王琦琦;像蛇一樣自我更新[N];中國青年報(bào);2013年

4 余爽;在快速變化的社會中保持自我更新與成長[N];黑龍江日報(bào);2018年

5 牛津大學(xué)博士 尹伊文;透明合法的“腐敗”：體制自我更新的教訓(xùn)[N];南方周末;2012年

6 牛津大學(xué)博士 尹伊文;透明合法的“腐敗”：體制自我更新的教訓(xùn)[N];南方周末;2012年

7 本報(bào)記者 吳兢;鞍鋼：走自我更新之路[N];人民日報(bào);2000年

8 華東師范大學(xué)基礎(chǔ)教育改革與發(fā)展研究所 李家成;在相通中實(shí)現(xiàn)教育自我更新[N];光明日報(bào);2014年

9 鐘沛璋;堅(jiān)持自我更新是革命者的情懷[N];中國教育報(bào);2008年

10 力納;政府應(yīng)助中小出口加工企業(yè)完成自我更新[N];消費(fèi)日報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 盧巖;OCT4通過調(diào)節(jié)DNMTs/p21信號維持人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和抑制衰老的作用[D];吉林大學(xué);2019年

2 于淼瑛;表皮生長因子受體功能缺失對小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性影響的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

3 魏于棟;DMRT1調(diào)控山羊雄性生殖干細(xì)胞分化、自我更新的機(jī)理[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

4 宋獻(xiàn)民;細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子在造血干細(xì)胞自我更新調(diào)控中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

5 趙明;人胚胎干細(xì)胞自我更新相關(guān)新基因的克隆及功能研究[D];中南大學(xué);2008年

6 金佳麗;USP21調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新及重編程的功能及其機(jī)制的研究[D];華東師范大學(xué);2017年

7 魏青;小分子SC1維持小鼠干細(xì)胞自我更新分子機(jī)制的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

8 李雅木;轉(zhuǎn)錄因子PRRX1通過激活多巴胺受體基因DRD2的表達(dá)來維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新和成瘤性[D];武漢大學(xué);2015年

9 劉爍;FOXP3對結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的影響及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2017年

10 傅子文;果蠅基因Twin在卵巢生殖干細(xì)胞系的維持和分化中的作用[D];清華大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王小虎;Tfcp211誘導(dǎo)Esrrb表達(dá)促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2019年

2 孫紅偉;IWR1維持人胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2019年

3 白紅霞;細(xì)胞外基質(zhì)剛度對腫瘤細(xì)胞自我更新的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D];電子科技大學(xué);2018年

4 湯玲;Sp5維持小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2018年

5 劉奎升;Tfcp2l1促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2018年

6 謝曉靜;論教師的教育習(xí)慣及其更新[D];曲阜師范大學(xué);2015年

7 林敏;bFGF激活PI3K信號通路調(diào)控大鼠胚胎干細(xì)胞自我更新[D];浙江理工大學(xué);2016年

8 呂林潔;人胚胎干細(xì)胞分化為可自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

9 何貴成;CAS抑制MHCC97干樣細(xì)胞自我更新的研究[D];南華大學(xué);2014年

10 武思宇;深度測序法篩選和鑒定維持奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因子[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

本文編號：2701734