【摘要】：目的口腔牙周支持組織破壞是牙周炎的主要表現(xiàn),同時也是牙脫落的主因。隨著再生醫(yī)學這個概念的創(chuàng)立以及組織再生技術這些年的發(fā)展,從病人體內(nèi)獲取種子細胞并在體外擴大增殖再輸入組織缺損的部位,以重構患者殘缺的牙周組織,是解決牙周喪失問題新的發(fā)展方向。但干細胞體外培養(yǎng)中使用的動物血清成分復雜,在未來臨床應用中可能引發(fā)異基因的免疫反應以及潛在的人畜共患病等風險。血小板裂解液(Human Platelet Lysate,HPL)是血小板破裂后,儲存于血小板α顆粒內(nèi)的大量生長因子釋放至外環(huán)境中所獲得的一種生長因子富集物。本實驗探索HPL對人牙髓間充質細胞(human Dental Pulp Mesenchymal Cells,h DPSCs)體外增殖與成骨分化的影響并研究其作用機制,為HPL替代胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作用于h DPSCs的體外擴增提供依據(jù)。方法分別使用5%、10%、20%的HPL以及10%FBS對健康牙髓組織分別進行原代培養(yǎng)。細胞成活后使用倒置熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察細胞形狀與狀態(tài),并計算組織塊的成活率;流式細胞術對間充質干細胞特異性的表面抗原CD34、CD45、CD44、CD90、CD105以及Stro-1的表達進行檢測;使用增殖及毒性檢測試劑盒(cell proliferation and toxicity test kit,cck-8)分別在1d、2d、3d至7d檢測細胞的增殖情況;臺盼藍溶液染色實驗檢測細胞之活性;實時熒光下聚合酶鏈式的反應(Real time quantitive-polymerase chain reaction,Q-PCR)檢測成骨相關基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)以及runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表達;茜素紅溶液法染色檢測細胞體外成骨礦化能力。所獲得所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結果各實驗組與對照組均有成纖維細胞樣細胞從組織塊中長出,倒置熒光顯微鏡與掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)相似,均為長梭形,偶見多角形。流式細胞儀檢測結果顯示CD34(㧟),CD45(㧟),CD44(㧏),CD90(㧏),CD105(㧏),Stro-1(㧏),其符合人間充質來源干細胞的表型特征;cck-8結果顯示10%HPL組h DPSCs增殖速度相較于10%FBS組更快,5%HPL組在第4d時與10%FBS組細胞增殖速度相當,各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。茜素紅染色顯示10%HPL組細胞成骨能力優(yōu)于10%FBS組;Q-PCR結果表明10%HPL組在成骨基因BMP-2,ALP,OCN以及RUNX2的表達方面,均優(yōu)于10%FBS組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論10%HPL可以有效促進人牙髓間充質細胞的體外擴增以及成骨分化,可以代替FBS作為牙髓間充質細胞體外擴增時的添加物,為牙髓間充質干細胞的臨床安全應用提供了理論基礎。
【圖文】：

胞培養(yǎng) 5-12 d 后，各組均有成纖維細胞樣細胞從組織塊邊緣爬出，，規(guī)則呈長梭形，并以旋渦狀排列，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞胞膜完整，細量的細胞基質；使用 HPL 培養(yǎng)的細胞立體感更強，期間可以發(fā)現(xiàn)少（圖 1，圖 2）。

圖 2 SEM 下細胞形態(tài)Fig 2 Cell morphology under SEM胞活性的檢測結果顯示：10% HPL 組細 HPL 組細胞的活性最低（68.583±3.519%P=0.0281）（表 2）。表 2 各組細胞細胞成活率、活率（ x ± s）2 Cell survival rate and activity of each group（ x0% FBS 5% HPL 10% HPL 0±8.2 26.7±4.7 70±14.1 5±1.882 68.583±3.519 88.424±1.866
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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