【摘要】：背景:Hippo信號(hào)通路是協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞增殖和分化,控制器官大小和組織再生的信號(hào)通路。核心激酶large tumor suppressor 1/2(LATS1/2)和mammalian Sterile 20-like kinases 1/2(MST1/2)被上游信號(hào)激活后,抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子yes-associated protein(YAP)/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif(TAZ)入核,進(jìn)而負(fù)向調(diào)控器官發(fā)育與再生。除了參與控制器官大小和組織再生外,Hippo信號(hào)通路在干細(xì)胞及祖細(xì)胞自我更新、代謝、免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。LATS1/2是否磷酸化YAP是Hippo信號(hào)通路激活與關(guān)閉的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但LATS1/2作為抑癌基因,對(duì)其獨(dú)立于YAP發(fā)揮功能的研究較少。肝臟是人體最大的代謝器官之一,而Hippo信號(hào)通路對(duì)肝癌和肝臟的再生等都有很重要的作用,但是Hippo信號(hào)通路和代謝的相關(guān)研究較之其他調(diào)控領(lǐng)域更少。因此,本論文將肝臟組織mRNA構(gòu)建成酵母菌株文庫(kù),通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)(Yeast Two-Hybrid Systems,Y2H)篩選肝臟中與LATS2互作的蛋白并進(jìn)一步研究其功能。YAP作為Hippo信號(hào)通路發(fā)揮作用的下游效應(yīng)分子,對(duì)Hippo信號(hào)通路行使功能必不可少,雖然已有相關(guān)研究鑒定出影響YAP活性的直接或間接調(diào)控因子(AMOT,VGLL4和BRD4),但是關(guān)于YAP的生物學(xué)功能仍然存在一些問(wèn)題尚待解決,例如YAP如何結(jié)合表觀因子,YAP的C端轉(zhuǎn)錄激活域如何發(fā)揮功能等。為了系統(tǒng)解決這些問(wèn)題,本課題利用BioID(proximity-dependent biotin identification)方法篩選YAP潛在的互作蛋白。該方法主要基于一種改造的生物素連接酶BirA*,它能將鄰近蛋白進(jìn)行生物素化標(biāo)記,通過(guò)鏈霉親和素珠子將生物素標(biāo)記的蛋白進(jìn)行富集,被生物素化的蛋白通過(guò)質(zhì)譜分析,可初步鑒定出YAP鄰近的蛋白和潛在的互作蛋白。目的:分別利用酵母雙雜交和BioID蛋白互作組學(xué)方法,尋找和Hippo信號(hào)通路核心因子LATS2和YAP互作的蛋白,并進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證和分析,為研究Hippo信號(hào)通路的調(diào)控和病理學(xué)功能提供依據(jù)。方法:選取LATS1/2蛋白中的LATS2,將它的相關(guān)結(jié)構(gòu)域與Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建成融合質(zhì)粒,通過(guò)免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)。對(duì)融合質(zhì)粒進(jìn)行自激活和毒性測(cè)試,確認(rèn)可以進(jìn)行酵母雙雜交篩選后,將表達(dá)融合質(zhì)粒的菌株與肝臟組織的酵母菌株文庫(kù)共同孵育,篩選肝臟組織中與LATS2互作的蛋白,通過(guò)報(bào)告基因(His3、LacZ和Leu2)的表達(dá)篩選出陽(yáng)性克隆并利用測(cè)序比對(duì)篩選正確整合表達(dá)的蛋白,將選擇的候選蛋白與HA標(biāo)簽融合表達(dá),LATS2與Flag標(biāo)簽融合表達(dá),共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)候選蛋白和LATS2的互作。YAP作為轉(zhuǎn)錄共激活因子,在酵母雙雜交系統(tǒng)中存在自激活現(xiàn)象。因此,采用BioID方法來(lái)篩選YAP的互作蛋白。將結(jié)果進(jìn)行聚類、通路和功能分析,從中挑選40個(gè)候選基因,每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩條特異性的shRNA,利用TBS-Luciferase雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)候選基因敲低對(duì)YAP活性的影響,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)候選基因敲低對(duì)Hippo信號(hào)通路下游靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果:通過(guò)酵母雙雜交篩選到肝臟組織中與LATS2互作的蛋白有22種(PARP9、FGA、SERPINF1、PLOD1、RBP4、AZGP1、AOX1、MST122、MST127、HPX、ATP synthase6、CP、EF1a、WDR6、POLR1B、HPN、NOL11、ZNF350、PSAP、FGB、NR2F6、ALDH2),選擇PARP9、WDR6、NOL11、AZGP1、ZNF350、HPX、ALDH2、AOX1作為候選蛋白進(jìn)行酵母雙雜交回復(fù)驗(yàn)證,并用磷酸化預(yù)測(cè)工具(http://www.phosphonet.ca/default.aspx)預(yù)測(cè)它們是否可以被LATS1/2磷酸化以及磷酸化的位點(diǎn)。根據(jù)回復(fù)驗(yàn)證和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果選擇PARP9、WDR6、NOL11、ALDH2、AOX1進(jìn)行互作驗(yàn)證,免疫共沉淀結(jié)果顯示:ALDH2(Aldehyde dehydrogenase,mitochondrial)和LATS2存在較強(qiáng)的相互作用,已知ALDH2參與酒精代謝,且酒精中毒與ALDH2密切相關(guān)。這提示我們:LATS2可能參與ALDH2調(diào)節(jié)的酒精代謝。通過(guò)BioID技術(shù)篩選到293T細(xì)胞中與YAP鄰近的蛋白有1000多種,經(jīng)聚類、通路和功能分析,發(fā)現(xiàn)有機(jī)械張力、細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳等相關(guān)基因可能參與調(diào)控YAP,其中已知的有NEDD4、CBLC、HSP90AB2P、CDK2、LATS、MST和AMOT,未知的有WDR26、STRAP、TRIM25、RANBP2、TFG、KHSRP、TES、SEPT7等。與KEGG收錄的Hippo信號(hào)通路成員和Biogrid收錄的與YAP1互作的蛋白進(jìn)行比對(duì)后,選擇40個(gè)基因作為候選基因,通過(guò)TBS-Luciferase雙熒光報(bào)告系統(tǒng)和qPCR分別檢測(cè)候選基因敲低對(duì)YAP活性和Hippo信號(hào)通路下游靶基因的影響,結(jié)果顯示:PRDX6、TPD52、TRIM25和TRIM33的敲低抑制YAP的活性及其靶基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:LATS1/2可能參與ALDH2調(diào)控的酒精代謝;利用BioID方法篩選出多個(gè)YAP的調(diào)節(jié)因子如COR1B、TRIM25、TRIM33等。這提示還有更多機(jī)械張力、細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳等相關(guān)基因可能參與調(diào)控YAP的活性。
【圖文】：

圖 1. Hippo 信號(hào)通路示意圖LATS2作為Hippo信號(hào)通路核心激酶中的一員，在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用。LATS2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，N-端有一個(gè) PPxY（P：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一個(gè) UBA 結(jié)構(gòu)域（ubiquitin associateddomain），PPxY 基序可以和有 WW 結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合（如：YAP 和 TAZ），在 N-端還有一個(gè)可以和蛋白質(zhì)互作的結(jié)構(gòu)：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重復(fù)（PAPArepeat），，每個(gè)結(jié)構(gòu)都可在機(jī)體內(nèi)參與特定的生命過(guò)程[7]（圖 2）。在哺乳動(dòng)物各組織器官中LATS2 廣泛表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，在人心臟和骨骼肌中的表達(dá)高于其它組織[9-11]。LATS2 參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、組織器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過(guò)程[12-14]。

圖 1. Hippo 信號(hào)通路示意圖LATS2作為Hippo信號(hào)通路核心激酶中的一員，在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要S2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，N-端有一個(gè)：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一個(gè) UBA 結(jié)構(gòu)域（ubiquitin assoain），PPxY 基序可以和有 WW 結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合（如：YAP 和 TAZ），有一個(gè)可以和蛋白質(zhì)互作的結(jié)構(gòu)：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重復(fù)（PAPArepe結(jié)構(gòu)都可在機(jī)體內(nèi)參與特定的生命過(guò)程[7]（圖 2）。在哺乳動(dòng)物各組織器S2 廣泛表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，在人心臟和骨骼肌中的表達(dá)高于其它組織S2 參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、組織器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過(guò)程[12-14]。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳敬騰;方碩;郭衛(wèi)春;;Hippo信號(hào)通路在骨肉瘤中的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2019年10期

2 劉思伽;全紫瑤;胡必成;謝圣高;;Hippo-YAP通路與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2019年07期

3 Wei Kang;Alfred SL Cheng;Jun Yu;Ka Fai To;;Emerging role of Hippo pathway in gastric and other gastrointestinal cancers[J];World Journal of Gastroenterology;2016年03期

4 ;This Old Hippo Has a New Trick——New Regulatory Mode of Hippo-YAP Pathway Inspires Unconventional Cancer Therapy[J];Bulletin of the Chinese Academy of Sciences;2016年03期

5 Lucy;;A Hippo[J];小學(xué)生導(dǎo)刊(中年級(jí));2019年05期

6 張顏明;;葉建軍執(zhí)教In the Children's Garden賞析[J];小學(xué)教學(xué)設(shè)計(jì);2016年36期

7 陳格亦桑;;找到屬于自己的鑰匙[J];快樂(lè)語(yǔ)文;2017年25期

8 ;Hippo signaling:A hub of growth control,tumor suppression and pluripotency maintenance[J];遺傳學(xué)報(bào);2011年10期

9 王兵兵;黃澤月;尹慧萍;王建剛;;壁虎超濾組分通過(guò)激活Hippo信號(hào)通路抑制人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)作用[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2019年10期

10 楊雪;楊吉安;陳謙學(xué);;Hippo信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展[J];中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志;2017年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 汪洋;;Regulation of Hippo pathway through alternative splicing[A];第九屆全國(guó)核糖核酸學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2016年

2 Lanfen Chen;Dawang Zhou;;The role of Hippo signaling in maintaining organelle homeostasis[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2016年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2016年

3 Huadong Pei;;Regulation of the Hippo-YAP Pathway by Glucose[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2016年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2016年

4 Lanfen Chen;Dawang Zhou;;Hippo signaling in organ size control and diseases[A];第十一次全國(guó)基因功能與表觀遺傳調(diào)控學(xué)術(shù)研討會(huì)摘要集[C];2015年

5 Siqi Zhao;袁增強(qiáng);;Hippo signaling pathway regulates microglial activation with application in the stroke protection[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第24屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2014年

6 Niannian Li;Xiaoling Tong;Jie Zeng;Gang Meng;Fuze Sun;Hai Hu;Jiangbo Song;Cheng Lu;Fangyin Dai;;Hippo pathway regulates somatic development and cell proliferation of silkworm[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第十四屆暨國(guó)家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家（柞）蠶遺傳育種學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2018年

7 彭澤旭;;Hippo通路主要組分在絕經(jīng)前后子宮組織中的表達(dá)和分布研究[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2018年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2018年

8 Zhan Yang;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——專題報(bào)告五[C];2014年

9 周大旺;;Hippo signaling in bile acid metabolism and cancer development[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2018年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2018年

10 王利宏;孫偉;王慶增;王悅;;探究Hippo信號(hào)通道中Lats2基因?qū)蚣∪馍L(zhǎng)發(fā)育的影響[A];2018年全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2018年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 黃實(shí);黃來(lái)強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在《美國(guó)科學(xué)院院刊》發(fā)文揭示腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控和他汀抗癌作用新機(jī)制[N];新清華;2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張軍;PKA通過(guò)Hippo信號(hào)通路抑制甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

2 張世浩;Hippo信號(hào)通路調(diào)控肝細(xì)胞多倍體和腫瘤發(fā)生的機(jī)理研究[D];廈門(mén)大學(xué);2017年

3 榮雪竹;EGFR漿/核轉(zhuǎn)位表達(dá)導(dǎo)致TKIs耐藥的分子機(jī)制[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

4 鮑乾坤;Hippo/YAP通路在血管新生中作用及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

5 劉陽(yáng);IKBKE激酶抑制劑amlexanox通過(guò)影響Hippo通路抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

6 韓強(qiáng);WWC3通過(guò)DVLs和LATS1影響Wnt通路和Hippo通路活性進(jìn)而抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

7 馮果欣;Hippo-RhoG信號(hào)通路維持線蟲(chóng)遷移細(xì)胞極性穩(wěn)定的機(jī)制研究[D];清華大學(xué);2017年

8 張瓊;Hippo信號(hào)通路效應(yīng)蛋白YAP/TAZ抑制COX-2轉(zhuǎn)錄的機(jī)制和功能研究[D];浙江大學(xué);2018年

9 吉新彥;YAP抑制劑的篩選及其抑制肝癌的功能和機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

10 許偉;Hippo信號(hào)關(guān)鍵因子TAZ調(diào)控EMT增敏肺癌靶向治療的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄒博;單核/巨噬細(xì)胞分化中PKC介導(dǎo)的Hippo通路活性改變對(duì)EndMT以及CXCR4表達(dá)的影響的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

2 余梓;PLEKHO1通過(guò)Hippo和MAPK/JNK信號(hào)通路調(diào)控腎癌細(xì)胞的細(xì)胞活性[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

3 陸攀;西格列汀通過(guò)激活Hippo通路及調(diào)控組織蛋白酶B的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

4 陳偉;Linc-RoR通過(guò)Hippo信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[D];江蘇大學(xué);2019年

5 高冰;肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2D激活肝癌Hippo/YAP通路的機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2019年

6 李莎莎;Hippo信號(hào)通路核心因子LATS2和YAP的互作組學(xué)篩選和驗(yàn)證[D];華中科技大學(xué);2019年

7 嚴(yán)文婷;去泛素化酶和四次跨膜蛋白家族成員對(duì)Hippo信號(hào)通路調(diào)節(jié)的系統(tǒng)分析與功能研究[D];華中科技大學(xué);2019年

8 路宇;益氣活血方通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo-YAP1通路抑制肝纖維化的機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

9 柏俊杰;Hippo通路調(diào)節(jié)端粒酶催化亞基hTERT表達(dá)的分子機(jī)制研究[D];杭州師范大學(xué);2019年

10 羅瑞晨;Hippo信號(hào)通路有關(guān)卵巢特異性lncRNA的篩選、驗(yàn)證及其與卵巢衰老相關(guān)性初探[D];南昌大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2692473