【摘要】：旋毛蟲(chóng)病是一種食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病,主要是由于生食或半生食含囊包幼蟲(chóng)的肉類所致。旋毛蟲(chóng)可引起發(fā)熱、面部水腫、肌肉疼痛等多種臨床表現(xiàn),嚴(yán)重感染可因并發(fā)癥而死亡。幼蟲(chóng)是旋毛蟲(chóng)的主要致病階段,尋找幼蟲(chóng)在侵入腸黏膜過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的蛋白酶尤為重要,組織蛋白酶B是木瓜蛋白酶樣的半胱氨酸蛋白酶,前期研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B能夠降解宿主的黏連蛋白、纖連蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白,與寄生蟲(chóng)的侵入與組織內(nèi)移行有關(guān),由此我們推測(cè)該蛋白可能參與了旋毛蟲(chóng)入侵宿主。本研究克隆表達(dá)了旋毛蟲(chóng)組織蛋白酶B(TsCB),并對(duì)其生物信息學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析,利用純化后的重組TsCB(rTsCB)制備免疫血清,然后對(duì)TsCB進(jìn)行免疫熒光定位、RT-PCR分析,并研究其與小鼠腸上皮細(xì)胞(IECs)的結(jié)合作用以及在侵入IECs中的功能,從而探究TsCB在旋毛蟲(chóng)入侵宿主IECs的作用。材料與方法1.旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及菌株本實(shí)驗(yàn)所用旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種為河南南陽(yáng)豬源地理株,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括昆明小鼠、BABL/c小鼠,均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)分離傳代得到的小鼠IECs,rTsCB表達(dá)菌株為BL21。2.TsCB生物信息學(xué)分析利用ExPasy網(wǎng)站對(duì)TsCB蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;在SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)TsCB是否具有信號(hào)肽;在TMHMM網(wǎng)站預(yù)測(cè)TsCB蛋白跨膜結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL網(wǎng)頁(yè)預(yù)測(cè)TsCB的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu);在NCBI中找到TsCB(Tsp-03306)相關(guān)信息,預(yù)測(cè)其酶活性位點(diǎn)。使用BioEdit軟件,將旋毛蟲(chóng)組織蛋白酶B與人、小鼠和其他寄生蟲(chóng)的組織蛋白酶B進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。3.TsCB的克隆表達(dá)及抗原性分析將TsCB基因連接到表達(dá)載體pQE-80L,原核表達(dá)出重組蛋白rTsCB,經(jīng)鎳柱親和純化后免疫小鼠制備小鼠抗rTsCB免疫血清,并收集ML粗抗原和ES抗原,進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot實(shí)驗(yàn),分析rTsCB的抗原性。4.TsCB在旋毛蟲(chóng)各蟲(chóng)期的表達(dá)及熒光免疫定位通過(guò)RT-PCR分析TsCB基因在不同蟲(chóng)期[肌幼蟲(chóng)(ML)、腸道感染性幼蟲(chóng)(IIL)、成蟲(chóng)(AW)、新生幼蟲(chóng)(NBL)]的轉(zhuǎn)錄水平,收集不同蟲(chóng)期的蟲(chóng)體,將新鮮蟲(chóng)體制成石蠟切片,進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TsCB在旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)及定位情況。5.TsCB與IECs的結(jié)合作用及其在旋毛蟲(chóng)侵入IECs中的作用通過(guò)ELISA、Western blot、Far-Western和熒光共聚焦顯微鏡檢查,將TsCB與IECs孵育后檢測(cè)兩者結(jié)合情況,并通過(guò)分離的IECs胞漿與胞核,進(jìn)一步驗(yàn)證TsCB和IECs的相互作用。然后進(jìn)行體外幼蟲(chóng)侵入實(shí)驗(yàn),將IIL幼蟲(chóng)加入DMEM半固體培養(yǎng)基中,覆蓋于IECs單層表面,在培養(yǎng)基中同時(shí)分別加入rTsCB和rTsCB免疫血清,孵育2h后鏡下觀察幼蟲(chóng)對(duì)IECs的侵入。6.干擾TsCB基因的表達(dá)對(duì)IIL侵入IEC的阻斷作用設(shè)計(jì)小干擾RNA(siRNA 596),沉默TsCB在肌幼蟲(chóng)的表達(dá),確定siRNA 596干擾的最佳濃度和持續(xù)時(shí)間,將干擾后的ML進(jìn)行體外侵入實(shí)驗(yàn),觀察沉默TsCB基因的表達(dá)對(duì)幼蟲(chóng)侵入IEC的阻斷作用。7.rTsCB免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用將30只BALB/c小鼠(雌性)隨機(jī)分成3組即rTsCB免疫組、佐劑組和PBS組,按每只小鼠20μg rTsCB蛋白皮下多點(diǎn)注射,間隔2周免疫,共免疫4次,末次免疫后每只小鼠經(jīng)口感染300條ML,感染6d后,剖殺小鼠,收集腸道中的成蟲(chóng)及培養(yǎng)后的新生幼蟲(chóng),計(jì)算成蟲(chóng)減蟲(chóng)率及新生幼蟲(chóng)產(chǎn)量,并對(duì)蟲(chóng)體體長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量,觀察形態(tài)變化。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,根據(jù)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)的類型選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,包括卡方檢驗(yàn)、單因素方差分析和t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水平為α0.05。結(jié)果1.TsCB生物信息學(xué)分析TsCB(accession No:NW_003526941.1)基因的生物信息學(xué)軟件及在線網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,TsCB基因序列全長(zhǎng)1071bp,編碼356個(gè)氨基酸,分子量約為40.23kDa,等電點(diǎn)為7.86。具有信號(hào)肽(1-29aa),N端有明顯的疏水區(qū),有1個(gè)跨膜區(qū)(12-35aa),存在有1個(gè)肽酶(peptidase_C1A)的結(jié)構(gòu)功能域,位于102-351aa,定位于細(xì)胞膜外。TsCB二級(jí)結(jié)構(gòu)包含有7個(gè)α-螺旋、13個(gè)β-折疊,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)有4個(gè)酶活性位點(diǎn)分別為:組氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn),他們緊密排布于該蛋白分子空間結(jié)構(gòu)中。2.TsCB的克隆表達(dá)及抗原性分析將TsCB基因連接到克隆載體pMD19-T中,雙酶切后將TsCB連接到表達(dá)載體pQE-80L,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/TsCB,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中,將陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行測(cè)序鑒定,將連接成功的單菌落加2 mM IPTG,37℃誘導(dǎo)6h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE,發(fā)現(xiàn)pQE-80L/TsCB在39.7kDa處出現(xiàn)一條蛋白帶,可溶性分析顯示rTsCB以包涵體形式存在,將rTsCB免疫小鼠制備鼠抗rTsCB血清。Western blot分析顯示,純化后的rTsCB蛋白可被抗rTsCB血清識(shí)別,但不能被旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清識(shí)別,與正常小鼠血清無(wú)交叉反應(yīng);抗rTsCB血清可識(shí)別旋毛蟲(chóng)不同期蟲(chóng)體(ML,IIL,AW,NBL)粗抗原中天然的TsCB,但不能識(shí)別ES抗原中的TsCB,表明TsCB是旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白中的成份。3.TsCB在旋毛蟲(chóng)各蟲(chóng)期的表達(dá)及熒光免疫定位RT-PCR結(jié)果表明TsCB基因在旋毛蟲(chóng)不同期蟲(chóng)體(ML,IIL,AW,NBL)均有轉(zhuǎn)錄,蟲(chóng)體切片免疫熒光顯示TsCB主要定位于蟲(chóng)體桿狀體、皮層和雌成蟲(chóng)的胚胎。4.間接ELISA檢測(cè)rTsCB與IECs的結(jié)合用不同濃度IECs包板,與10μg/mL rTsCB孵育后,ELISA結(jié)果表明IECs蛋白最佳包被濃度為3.2μg/mL。然后以此濃度包板,與不同濃度的rTsCB蛋白孵育,結(jié)果表明rTsCB濃度達(dá)到1.75μg/mL時(shí),rTsCB與IEC蛋白充分結(jié)合。OD值隨著IEC包被濃度的增加而升高(F=298.187,P0.01),兩者具有相關(guān)性(r=0.743,P0.05);此外,OD值也隨著rTsCB孵育濃度的加大而增加(F=458.891,P0.01),二者也具有顯著相關(guān)性(r=0.953,P0.01),表明重組蛋白可以和IECs結(jié)合。5.Western blot分析rTsCB與IECs的特異性結(jié)合rTsCB與活的IECs孵育2h后,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示抗rTsCB免疫血清識(shí)別了7條IECs的蛋白帶,而感染血清識(shí)別了5條帶,正常血清不能識(shí)別。然而,抗rTsCB血清不能識(shí)別經(jīng)BSA孵育后的IECs蛋白。將IECs胞漿蛋白和胞核蛋白分別與rTsCB孵育后進(jìn)行的Western blot結(jié)果顯示,抗rTsCB血清分別識(shí)別5條胞漿蛋白帶和3條胞核蛋白帶,表明TsCB與IECs的結(jié)合位點(diǎn)是在IEC胞漿與胞核。6.Far western和IFA驗(yàn)證rTsCB與IECs相互作用Far-Western結(jié)果顯示IECs蛋白能被抗rTsCB血清和旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清識(shí)別,但不能被正常小鼠血清識(shí)別;抗rTsCB血清能識(shí)別IEC全細(xì)胞蛋白中的8條帶,胞漿蛋白中的7條和胞核蛋白中6條帶,再次表明rTsCB能夠與IECs結(jié)合,共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),rTsCB能夠與IECs特異性結(jié)合,更加直觀形象的表明rTsCB能夠與IEC結(jié)合,結(jié)合部位在的IECs的胞漿與胞核。7.rTsCB與抗rTsCB血清對(duì)旋毛蟲(chóng)體外侵入IECs的促進(jìn)與抑制作用體外侵入結(jié)果表明,rTsCB對(duì)IIL幼蟲(chóng)侵入IECs有顯著地促進(jìn)作用,這種促進(jìn)作用呈劑量依賴性(r=0.985,P0.01),且隨著抗rTsCB蛋白濃度的增加,促進(jìn)侵入作用增強(qiáng)(F=341.596,P0.01),但BSA并無(wú)促進(jìn)幼蟲(chóng)入侵作用。將IIL加入IECs單層后幼蟲(chóng)能夠侵入細(xì)胞單層。與PBS組相比較,抗rTsCB血清(1:100-1:600)能夠明顯抑制幼蟲(chóng)的對(duì)IECs侵襲(P0.01)�？箁TsCB抗體的抑制作用呈劑量依賴性(r=0.974,P0.01),隨著血清稀釋度的增加呈下降趨勢(shì)(F=90.963,P0.01)。此外,小鼠免疫前血清和單佐劑免疫小鼠血清對(duì)幼蟲(chóng)入侵無(wú)明顯的抑制作用。8.沉默TsCB基因?qū)IL侵入IECs的阻斷作用利用電穿孔法將不同終濃度的siRNA 596轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng),進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明在siRNA 596濃度為1μM、1.5μM、2μM和2.5μM時(shí),TsCB表達(dá)量分別被抑制了19.61%、41.35%、75.47%及72.38%。,因此siRNA 596濃度為2μM時(shí)的干擾效果最好。將2μM siRNA 596導(dǎo)入蟲(chóng)體培養(yǎng)2天后TsCB蛋白表達(dá)量被抑制了89.49%。體外侵入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA 596干擾組與PBS組相比,兩組幼蟲(chóng)侵入率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.632,P0.01),沉默TsCB基因?qū)τ紫x(chóng)侵入IEC抑制率為49.96%。9.rTsCB誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型及免疫保護(hù)作用分析rTsCB免疫小鼠后,血清中IgG抗體明顯升高,在第2次免疫后,IgG1及IgG2a水平也明顯升高,但I(xiàn)gG1升高水平更為顯著(t_(4w)=4.350,t_(6w)=4.247,t_(8w)=2.902,P0.01),因而rTsCB免疫小鼠主要誘導(dǎo)的是Th2型免疫反應(yīng)。rTsCB免疫小鼠攻蟲(chóng)感染后6d,成蟲(chóng)的減蟲(chóng)率為52.81%,與PBS組相比差異顯著(F=63.80,P0.01),佐劑組與PBS組成蟲(chóng)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.4,P0.05)。對(duì)雌、雄成蟲(chóng)的體長(zhǎng)分別進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果表明與PBS組和佐劑組相比,rTsCB免疫組雌成蟲(chóng)體長(zhǎng)明顯變短(F=19.390,P0.01),而雄成蟲(chóng)體長(zhǎng)變化3組間無(wú)明顯差異(F=1.849,P0.05)。此外,rTsCB免疫組新生幼蟲(chóng)產(chǎn)量與PBS組相比,明顯減少(F=11.153,P0.01),對(duì)新生幼蟲(chóng)體長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn),rTsCB免疫組新生幼蟲(chóng)體長(zhǎng)變短,與PBS組差異顯著。(F=24.788,P0.01)。結(jié)論1.成功構(gòu)建了旋毛蟲(chóng)組織蛋白酶B(TsCB)重組原核表達(dá)質(zhì)粒PQE-80L/TsCB,并誘導(dǎo)表達(dá)出rTsCB;2.TsCB在旋毛蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),主要定位于蟲(chóng)體桿狀體、皮層和雌蟲(chóng)的胚胎;3.rTsCB能夠與小鼠腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合,對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞有明顯的促進(jìn)作用,而抗rTsCB血清能夠顯著抑制幼蟲(chóng)對(duì)腸上皮細(xì)胞的侵入;沉默TsCB基因亦明顯抑制了旋毛蟲(chóng)對(duì)小腸上皮細(xì)胞的侵入;rTsCB對(duì)小鼠具有較好的免疫保護(hù)作用。因此,TsCB是旋毛蟲(chóng)侵入宿主腸上皮細(xì)胞的相關(guān)蛋白。
【圖文】：

疫保護(hù)作用性 BABL/c 小鼠進(jìn)行攻蟲(chóng)感染，每只小鼠灌胃 3后的新生幼蟲(chóng)，并對(duì)其進(jìn)行體長(zhǎng)測(cè)量和計(jì)數(shù)，，結(jié)息學(xué)分析化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能分析 旋毛蟲(chóng)組織蛋白酶 B（c軟件及在線網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TsCB 基序列全長(zhǎng) 1071bp，編碼 356 個(gè)氨基酸，分子量約號(hào)肽，位于 1-29aa（圖 1），N 端有明顯的疏水區(qū)有 1 個(gè)肽酶（peptidase_C1A）的結(jié)構(gòu)功能域（圖 4蛋白可能為分泌蛋白（圖 5）。二級(jí)結(jié)構(gòu)包含有 7）（圖 6、圖 7-a），三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)有 4 個(gè)酶活性位點(diǎn)氨酰胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn構(gòu)中。

個(gè)肽酶（peptidase_C1A）的結(jié)構(gòu)功能域（圖可能為分泌蛋白（圖 5）。二級(jí)結(jié)構(gòu)包含有圖 6、圖 7-a），三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)有 4 個(gè)酶活性胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（。圖 1 TsCB 信號(hào)肽預(yù)測(cè)TsCB 蛋白具有信號(hào)肽，位于 1-29aa 之間
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R383.15

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本文編號(hào)：2688049