本文關鍵詞：GⅡ-4型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的分析GII-4型諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列,了解其基因結構的特點以及基因組類型。應用分子生物學手段制備GII-4型No V P粒子,通過酶免疫分析試驗(Enzyme immune assays,EIA)為基礎的唾液結合實驗和寡糖結合實驗分析我國主要基因型95/96 US株、2006b株、Sydney株等3種毒株與組織血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs)的相關性,以獲得我國No V流行株與HBGAs的結合模式,從而確定諾如病毒流行株感染的宿主范圍,為進一步研究No V與宿主受體之間的關系及No V疫苗和防治藥物的研發(fā)提供實驗基礎和理論依據。方法1諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測定及分析:依據Sydney2012全基因組參考株進行引物的設計,用RT-PCR分段的方式對諾如病毒全基因組進行擴增,經過分子克隆的手段、測序以后再進行系統(tǒng)的進化分析。2制備GII-4型諾如病毒P粒子:選擇Sydney2012代表株3135,通過基因工程方法構建表達質粒p GEX4T1-P,將鑒定正確的p GEX4T1-P質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)菌,挑選單克隆菌落小量表達,SDS-PAGE鑒定是否有融合蛋白產生。隨后將保存菌種活化進行目的蛋白的大量表達,利用瓊脂糖-4B柱對P蛋白進行純化并通過凝血酶除去GST融合蛋白標簽以形成二十四聚體的P粒子。3分析不同型別諾如病毒株與組織血型抗原的親和性:利用ELISA唾液結合實驗分析3個型別的諾如病毒流行株與唾液中的HBGAs受體相結合的情況。利用HBGAs表型已明確的54份唾液樣本包被96孔酶標板,加純化的No V P粒子與之反應,以相應的鼠抗GII-4 No V P血清為一抗,二抗為HRP標記的山羊抗鼠Ig G,加入TMB顯色液,在酶標儀上的450nm波長處顯示的OD值。通過3個毒株的P蛋白對lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖進行EIA為基礎的寡糖結合實驗。綜合唾液結合及寡糖結合的實驗分析三個諾如病毒流行株與HBGAs受體的結合方式。結果1諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測定及分析:GII-4型諾如病毒廣州株GZ20133135病毒基因組全長7566bp,其病毒基因組分為三個開放閱讀框(ORFs),ORF1、ORF2及ORF3長度分別為5100bp、1623bp和807bp,ORF1與ORF2之間有19個核苷酸重疊。廣州株GZ20133135全基因組的序列與參考株GII-4型Sydney2012變異株序列的同源性最高,全長同源性為99.07%。通過系統(tǒng)的進化分析表明,廣州株GZ20133135株屬于GII-4 Sydney2012的變異株。通過對衣殼區(qū)541個氨基酸比對,Sydney2012變異株位點變化情況為:aa294 V或A或P→T,aa296 S或T→S,aa297H或Q→R,aa298D或N或T→N,aa368 T或N或S或A→E,aa372 N或S→D,aa393 N或D或S,aa394 T或G或S→T,aa395 T或A→T,aa407 N或D→S,aa412 T或D→N,aa413 G或I→T。2制備GII-4型諾如病毒P粒子:PCR擴增得到3135 P區(qū)序列,大小都為991bp。成功構建表達質粒4T1-3135 P,測序結果證實連接的表達片段長為972個核苷酸,編碼324個氨基酸。SDS-PAGE電泳分析證實成功表達了分子量約62k Da的可溶性的GST-P融合蛋白和分子量為36k Da的目的蛋白P蛋白。3分析不同型別諾如病毒株與組織血型抗原的親和性:通過P蛋白的唾液結合實驗分析得到3135-P、9711-P和55019-P諾如病毒與唾液HBGAs的結合模式。9711及55019株的P粒子與A、B、AB、O+型唾液能夠結合,而與O-型唾液則均不結合。3135株P粒子與A、B、AB、O+、O-型唾液均結合。通過寡糖結合實驗發(fā)現3135與lea、leb、A、B、H2型結合;55019與leb、ley、A、B、H2型寡糖結合;9711與leb、ley、A、B型寡糖結合。結論1廣州株GZ20133135株屬于GII-4 Sydney2012變異株;2成功構建諾如病毒表達質粒4T1-3135 P,并獲得目的蛋白P粒子;3 HBGAs與3135、9711和55019 GII-4型No V的結合呈現毒株特異性。由唾液及寡糖結合實驗綜合分析發(fā)現9711株及55019株的P粒子與A、B、AB、O+血型唾液能夠結合,與O-血型唾液則均不發(fā)生結合。3135株P粒子與A、B、AB、O+、O-血型唾液均結合。
【關鍵詞】：諾如病毒 GII-4型 組織血型抗原 結合模式
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第1章 諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測定及分析14-26
• 1.1 材料與方法14-20
• 1.1.1 標本14
• 1.1.2 主要試劑14
• 1.1.3 主要溶液配制14-15
• 1.1.4 主要儀器15-16
• 1.1.5 標本處理16
• 1.1.6 病毒核酸的提取16
• 1.1.7 病毒RNA逆轉錄16-17
• 1.1.8 病毒基因組擴增17-18
• 1.1.9 結果鑒定18-20
• 1.2 結果20-23
• 1.2.1 諾如病毒基因組結構特征20
• 1.2.2 諾如病毒基因組全序列比較20-21
• 1.2.3 1991年至今諾如病毒GII-4 型變異株ORF2區(qū)氨基酸位點變化情況分析101.3 討論21-23
• 1.4 結論23
• 參考文獻23-26
• 第2章 GII-4 型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關性研究26-46
• 2.1 材料和方法26-37
• 2.1.1 材料26-28
• 2.1.2 擴增廣州新爆發(fā)Sydney代表株 3135 P區(qū)基因序列28-29
• 2.1.3 pGEM-T Easy-P的TA克隆29-31
• 2.1.4 構建表達質粒pGEX4T1-P31-32
• 2.1.5 表達目的蛋白32-33
• 2.1.6 GST融合蛋白的純化33-34
• 2.1.7 唾液表型測定34-35
• 2.1.8 EIA檢測P蛋白與HBGAs受體的結合35-36
• 2.1.9 寡糖結合分析實驗36-37
• 2.2 結果37-42
• 2.2.1 擴增GII-4 型NVs P區(qū)基因序列37
• 2.2.2 構建PGEM-Teasy-P重組質粒37-38
• 2.2.3 構建PGEM-4T1-P表達質粒38
• 2.2.4 P蛋白的小量表達38-39
• 2.2.5 P蛋白的大量表達及純化39
• 2.2.6 唾液表型測定39-40
• 2.2.7 EIA檢測P蛋白與HBGAs受體的結合40-42
• 2.2.8 寡糖結合實驗42
• 2.3 討論42-45
• 2.4 結論45
• 參考文獻45-46
• 第3章 綜述46-59
• 3.1 諾如病毒基因組特征46
• 3.2 諾如病毒蛋白質46-47
• 3.2.1 非結構蛋白46-47
• 3.2.2 結構蛋白47
• 3.3 諾如病毒與宿主的相互作用47-49
• 3.4 諾如病毒流行病學特征49-50
• 3.5 諾如病毒感染的臨床表現50
• 3.6 諾如病毒檢測方法50-52
• 3.6.1 電鏡法50-51
• 3.6.2 免疫學方法51
• 3.6.3 分子生物學方法51-52
• 3.7 治療、預防及疫苗的研究52-53
• 3.8 小結53-54
• 參考文獻54-59
• 結論59-60
• 致謝60-61
• 導師簡介61-62
• 作者簡介62-63
• 學位論文數據集63

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：GⅡ-4型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：268631