【摘要】：目的:TRIM(Tripartite motif,TRIM)蛋白參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬和腫瘤等多種非常重要的生命進(jìn)程。我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示,呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)感染過程中,大部分TRIM蛋白表達(dá)明顯升高,提示TRIM蛋白在其中也發(fā)揮著重要的作用�，F(xiàn)有的研究顯示具有RING結(jié)構(gòu)域的TRIM蛋白大多具有泛素連接酶功能,但功能各異。當(dāng)病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí),機(jī)體通過固有免疫應(yīng)答首先對(duì)抗病毒入侵,其中,固有免疫應(yīng)答的一個(gè)重要方面是合成和分泌Ⅰ型干擾素(TypeⅠinterferon,IFN-Ⅰ),以阻止病毒從感染細(xì)胞向臨近未感染細(xì)胞擴(kuò)散。病毒入侵細(xì)胞后,不同的病毒基因會(huì)被胞內(nèi)不同受體感知并結(jié)合,其中,視黃酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ樣受體(Retinoic acid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors,RLRs)如RIG-Ⅰ可探測(cè)細(xì)胞中的病毒基因組RNA并與之結(jié)合,而TRIM25是這條通路的關(guān)鍵蛋白,其通過催化RIG-Ⅰ,誘導(dǎo)IFN-Ⅰ和其他炎癥因子的產(chǎn)生。有文獻(xiàn)報(bào)道TRIM38可抑制IFN-Ⅰ的產(chǎn)生。RSV屬于單鏈RNA病毒,是導(dǎo)致嬰兒和兒童支氣管炎和肺炎的主要原因。近年來,RSV不僅容易引起散發(fā)性感染,而且還可能爆發(fā)大規(guī)模感染,導(dǎo)致全世界呼吸道感染的流行。但RSV至今沒有合適的疫苗問世,因此,全球?qū)SV致病機(jī)制的深入研究從未停止。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中,用RSV感染人呼吸道上皮細(xì)胞后進(jìn)行全基因表達(dá)譜測(cè)序,結(jié)果顯示TRIM25及TRIM38的表達(dá)均明顯升高。二者在RSV病毒復(fù)制中具體發(fā)揮了什么作用?已知,TRIM25具有K63泛素連接酶活性,而TRIM38具有K48泛素連接酶活性,在RSV感染宿主細(xì)胞后,已知二者均參與調(diào)節(jié)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生,那么二者在誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生上是否存在交互作用?TRIM38是否競(jìng)爭(zhēng)抑制TRIM25對(duì)RIG-Ⅰ的結(jié)合?對(duì)于這些機(jī)理研究,目前還不甚明了。鑒于此,本課題擬選取RSV為病毒模型,就TRIM38與TRIM25對(duì)RSV感染肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生機(jī)制的影響進(jìn)行研究,為臨床治療RSV的實(shí)施方案提供新思路。方法:1 RSV對(duì)TRIM25和干擾素信號(hào)通路的影響1.1優(yōu)化感染復(fù)數(shù),最終選取感染復(fù)數(shù)為MOI=1的RSV-mGFP感染A549細(xì)胞(以后的實(shí)驗(yàn)均選取感染復(fù)數(shù)為MOI=1),選取感染的0 h,24 h,48 h,72 h,分別觀察RSV-mGFP綠色熒光的變化。1.2收取上述不同時(shí)間點(diǎn)的感染細(xì)胞,分別提取細(xì)胞總蛋白和總RNA,Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的TRIM25、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6、NF-κB和TRAF3的蛋白表達(dá);RT-qPCR評(píng)估IFN-α和IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。1.3將構(gòu)建的pCAGGS-HA-TRIM25的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中,免疫熒光檢測(cè)TRIM25在A549細(xì)胞中的定位。1.4 RSV感染雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞48 h后,收取細(xì)胞,按熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測(cè)IFN-β啟動(dòng)子的活性高低。2 TRIM25通過RIG-Ⅰ通路誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生。2.1將質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM25轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以過表達(dá)TRIM25,24 h后,RSV感染再作用該細(xì)胞24 h,提取總RNA,RT-qPCR檢測(cè)TRIM25、IFN-α和IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。2.2將質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM25和雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,RSV感染48 h,按試劑盒說明書進(jìn)行操作,判斷IFN-β啟動(dòng)子的活性變化。2.3 SiRNA敲低TRIM25后,RSV感染A549細(xì)胞48 h,提取總RNA,RT-qPCR檢測(cè)TRIM25敲低效果及IFN-α和IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平;提取細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測(cè)TRIM25蛋白水平的敲低效果,及RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6、NF-κB的表達(dá)。2.4以合適濃度的IMD0354(IKKβ抑制劑)預(yù)處理A549細(xì)胞30 min,加RSV病毒作用0 h,12 h,24 h,分別提取總蛋白和總RNA,Western blot檢測(cè)p-P65和P65的蛋白表達(dá),RT-qPCR檢測(cè)IFN-α和IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。3 TRIM38與TRIM25對(duì)RIG-Ⅰ途徑誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的影響3.1 RSV感染過表達(dá)TRIM25的A549細(xì)胞24 h后,Western blot檢測(cè)TRIM38的蛋白表達(dá)。3.2用不同劑量的人源IFN-β處理A549細(xì)胞12 h收取總RNA,以相同劑量IFN-β處理A549細(xì)胞,提取不同時(shí)間點(diǎn)總RNA,RT-qPCR分別檢測(cè)TRIM25和TRIM38的mRNA水平。3.3將Vero細(xì)胞(天然基因缺陷,不表達(dá)抗病毒干擾素)過表達(dá)TRIM25,再感染RSV24 h,Western blot檢測(cè)TRIM38的蛋白表達(dá)。3.4 RSV感染siRNA敲低TRIM38的A549細(xì)胞48 h后,Western blot檢測(cè)TRIM25和RIG-Ⅰ的表達(dá)。3.5構(gòu)建了pCAGGS-HA-TRIM38的真核表達(dá)質(zhì)粒,以不同濃度的pCAGGS-HA-TRIM38質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,RSV感染該細(xì)胞24 h后,提取總RNA,RT-qPCR檢測(cè)TRIM38、IFN-α和IFN-β的mRNA水平,提取總蛋白,Western blot檢測(cè)TRIM38、TRIM25和RIG-Ⅰ的蛋白表達(dá)。3.6將質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM25和濃度遞增的質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM38共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24 h后,提取總RNA,RT-qPCR檢測(cè)IFN-α和IFN-β的mRNA水平;提取總蛋白,Western blot檢測(cè)TRIM25、TRIM38和RIG-Ⅰ的蛋白表達(dá)。3.7將質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM25和質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM38共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,同時(shí)設(shè)單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM25和空載為對(duì)照。用RIG-Ⅰ的單克隆抗體對(duì)各個(gè)處理樣本的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行經(jīng)典磁珠式免疫沉淀,Western blot檢測(cè)TRIM25、TRIM38與RIG-Ⅰ蛋白,同時(shí)檢測(cè)全細(xì)胞裂解液中上述蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1 RSV-mGFP感染A549細(xì)胞0 h,24 h,48 h,72 h后,細(xì)胞的綠色熒光逐漸增加2 A549細(xì)胞感染RSV后,感染組IFN-α、IFN-β、TRIM25、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6及NF-κB的表達(dá)均顯著高于未感染組;熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示IFN-β啟動(dòng)子活性較Mock組亦顯著升高(P=0.0203),TRAF3的表達(dá)水平與未感染組無顯著差異。3 RSV感染過表達(dá)TRIM25的A549細(xì)胞,過表達(dá)組的TRIM38、IFN-α和IFN-β的表達(dá)水平顯著高于Mock組;雙熒光素酶報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示過表達(dá)組的IFN-β啟動(dòng)子活性顯著高于Mock組(P=0.0145)。4 RSV感染敲低TRIM25的A549細(xì)胞,敲低組的IFN-α和IFN-β的mRNA水平、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6和NF-κB的蛋白表達(dá)水平均低于Mock組。5 IKKβ抑制劑預(yù)處理A549細(xì)胞,RSV感染該細(xì)胞后,隨著p-P65的表達(dá)被抑制,IFN-α和IFN-β的表達(dá)水平顯著低于Mock組。6不同劑量人源的IFN-β處理A549細(xì)胞,或相同劑量IFN-β處理A549細(xì)胞不同時(shí)間,TRIM25和TRIM38的表達(dá)水平均明顯升高,且有劑量依賴關(guān)系。7 RSV感染過表達(dá)TRIM25的Vero細(xì)胞,過表達(dá)TRIM25組和空載組的TRIM38的蛋白表達(dá)沒有顯著差異。8 RSV感染敲低TRIM38的A549細(xì)胞后,RIG-Ⅰ的蛋白表達(dá)水平明顯高于Mock組。9 RSV感染不同濃度質(zhì)粒pCAGGS-HA-TRIM38轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞,TRIM38隨著質(zhì)粒濃度的增加表達(dá)量逐漸升高;與Mock組相比,過表達(dá)組的IFN-α和IFN-β的表達(dá)呈降低趨勢(shì)(P0.05);RIG-Ⅰ的蛋白表達(dá)亦呈減少趨勢(shì)。10共轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-TRIM25和不同濃度pCAGGS-HA-TRIM38的質(zhì)粒到A549細(xì)胞后,共轉(zhuǎn)染組的IFN-α和IFN-β的表達(dá)呈降低趨勢(shì)(P0.05);TRIM38及RIG-Ⅰ的蛋白表達(dá)均呈降低趨勢(shì)。11 RIG-Ⅰ能同時(shí)與TRIM25、TRIM38相互作用,在TRIM38存在的情況下,RIG-Ⅰ結(jié)合的TRIM25減少。結(jié)論:1 RSV感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)了TRIM25表達(dá),后者可能主要通過RIG-Ⅰ激活NF-κB途徑誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生。2 TRIM25誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的表達(dá),后者反饋性誘導(dǎo)了TRIM25及TRIM38的表達(dá)。3 TRIM38與TRIM25共存時(shí),TRIM38與TRIM25競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RIG-Ⅰ,從而抑制IFN-Ⅰ的表達(dá)。
【圖文】：

圖 1 熒光顯微鏡觀察 RSV-mGFP 感染的 A549 細(xì)胞Fig. 1 Fluorescence microscopy detection of RSV-mGFP infectedA549 cells(100 X).2.2 A549 感染 RSV 0 h，24 h，，48 h，72 h 后，Western blot 結(jié)果顯示感染組 TRIM25、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6 和 NF-κB 的蛋白表達(dá)水平與未感染組相比明顯升高，TRAF3 的表達(dá)水平與未感染組無顯著差異（Fig. 2）。AB

圖 1 熒光顯微鏡觀察 RSV-mGFP 感染的 A549 細(xì)胞Fig. 1 Fluorescence microscopy detection of RSV-mGFP infectedA549 cells(100 X).2.2 A549 感染 RSV 0 h，24 h，48 h，72 h 后，Western blot 結(jié)果顯示感染組 TRIM25、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6 和 NF-κB 的蛋白表達(dá)水平與未感染組相比明顯升高，TRAF3 的表達(dá)水平與未感染組無顯著差異（Fig. 2）。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2679058