【摘要】：鉀通道是功能性表達在細胞膜上允許K~+跨膜通過的離子通道,鉀通道廣泛存在于骨骼肌、心臟、神經(jīng)、胃腸道和淋巴細胞中,是目前發(fā)現(xiàn)的功能最復雜、亞型最多的一類離子通道。Kv1.3是一種電壓門控鉀通道,在淋巴細胞中高表達,現(xiàn)有研究表明:Kv1.3參與了人體自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,在自身免疫性疾病患者中,Kv1.3在外周血TEM細胞中和患處的表達量高于正常人;在多發(fā)性硬化癥、牛皮癬和類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病動物模型中,Kv1.3抑制劑表現(xiàn)出對其動物模型很好的治療效果,目前已有一種Kv1.3的多肽毒素抑制劑已經(jīng)針對牛皮癬的治療進入臨床II期。自身免疫性疾病主要包括牛皮癬、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、1-型糖尿病和克羅恩等疾病,現(xiàn)有的針對自身免疫性疾病的治療方式主要為廣譜的免疫抑制劑和抗炎藥物。雖然這些藥物在一定程度生能夠緩解自身免疫性疾病的病情,但是這些藥物也存在一個明顯的副作用,就是這些藥物沒有明確的作用靶點,在緩解病情的同時也會對身體其他組織器官造成傷害。所以,急需有明確靶點的藥物進入自身免疫性疾病治療領域。雖然有許多靶向于Kv1.3的藥物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應用于臨床,但在藥物的篩選上,還需要發(fā)現(xiàn)更多的親和性更強,選擇性更好的靶向于Kv1.3的藥物。不僅如此,在Kv1.3與更多的自身免疫性疾病的關系闡述上還有待更深入的研究。本研究利用本實驗室以前從雷氏大疣蛛中發(fā)現(xiàn)的一種Kv1.3抑制劑RTX-Ⅷ展開了與自身免疫性疾病相關的研究。RTX-Ⅷ含有35個氨基酸殘基,其IC50值為36.3 nM,含有6個半胱氨酸,形成3對二硫鍵。首先通過化學合成的方式合成了RTX-Ⅷ,但由于復性產(chǎn)率較低,只占線性多肽的15%左右,故后續(xù)又采用大腸桿菌原核表達的方式獲取RTX-Ⅷ,采用PET43a(+)載體和Shuffle菌種,表達的RTX-Ⅷ具有和野生型RTX-Ⅷ同樣的活性,表達量為15 mg/L。獲取了足夠的RTX-Ⅷ用于后續(xù)自身免疫性疾病動物模型實驗。雖然RTX-Ⅷ具有對Kv1.3很好的選擇性和親和力,但RTX-Ⅷ是否對于自身免疫性疾病模型有很好的治療效果還需進一步驗證。于是,構建了科學家已經(jīng)證明過的Kv1.3抑制劑具有很好藥效的多發(fā)性硬化癥大鼠模型(實驗性腦脊髓炎,EAE)和K14-VEGF牛皮癬小鼠模型來評價RTX-Ⅷ的藥效。實驗結果表明:1 mg/kg的RTX-Ⅷ對EAE模型大鼠表現(xiàn)出很好的治療效果,并且能夠降低模型治療組中炎性因子的分泌;緊接著,又利用K14-VEGF牛皮癬小鼠來評價RTX-Ⅷ對牛皮癬的治療效果,結果表明:RTX-Ⅷ同樣對牛皮癬小鼠具有很好的治療效果。在RTX-Ⅷ的藥物代謝動力學和毒性實驗中,研究發(fā)現(xiàn)RTX-Ⅷ在大鼠體內(nèi)30 min時達到峰值,而在1 h時就會被降解完全,且RTX-Ⅷ主要通過大鼠的肝臟進行代謝,少部分通過大鼠腎臟進行代謝,即使RTX-Ⅷ通過大鼠的腎臟和肝臟進行代謝,但是在有效劑量100倍的情況下,RTX-Ⅷ并不對小鼠的肝臟和腎臟產(chǎn)生明顯的毒副作用,并且不影響老鼠的行為學。雖然Kv1.3與多發(fā)性硬化癥、牛皮癬等自身免疫性疾病的關系已經(jīng)清楚,但Kv1.3與克羅恩病的關系還需進一步深入研究。所以首次研究了Kv1.3與克羅恩疾病的關系。1、從臨床水平:從臨床確診為克羅恩病人和正常人的外周血中分離TEM細胞,通過膜片鉗記錄TEM細胞上Kv1.3的電流,從而計算功能性表達在膜上的Kv1.3的數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn):在克羅恩病人中Kv1.3的表達量相比于正常人要高三倍,通過RT-qPCR檢測K1.3的mRNA在克羅恩病人和正常人的表達量,同樣發(fā)現(xiàn)在mRNA水平,在克羅恩病人中的表達量要比正常人高5倍左右,通過免疫組化檢測克羅恩病人腸粘膜和正常人腸粘膜樣本,發(fā)現(xiàn)在克羅恩病人腸粘膜中Kv1.3的表達量要高于正常人組;結果確認Kv1.3在克羅恩病人中高表達。2、從動物模型水平:建立大鼠克羅恩疾病模型,利用RTX-Ⅷ作為藥物治療模型組大鼠,結果發(fā)現(xiàn):1 mg/kg和2 mg/kg的RTX-Ⅷ能夠在一定程度上緩解大鼠克羅恩癥狀,并且能夠在體內(nèi)降低大鼠Kv1.3在mRNA和蛋白質水平的表達。RTX-Ⅷ能夠降低大鼠體內(nèi)IL-2、TNF-a、IFN-g和IL-17A等炎性因子的分泌,其藥效和臨床藥物英夫利昔單抗的藥效基本一致。結果表明:RTX-Ⅷ對克羅恩病的治療效果和英夫利昔單抗的治療效果基本一致。由于現(xiàn)有的Kv1.3的多肽毒素抑制劑已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多,尤其是在蝎子和�？疽褐邪l(fā)現(xiàn)了大量的Kv1.3抑制劑,而在蜘蛛毒素中發(fā)現(xiàn)的Kv1.3抑制劑很少,不僅如此,在蝎子和�？械腒v1.3多肽毒素抑制劑對Kv1.3的IC50極低,通常在皮摩爾水平,而我們發(fā)現(xiàn)的RTX-Ⅷ相比于現(xiàn)有的多肽毒素也具有很明顯的優(yōu)勢:1、現(xiàn)在進入臨床的來自于海葵中的多肽毒素ShK-186,是基于�？嚯亩舅豐hK進行修飾的多肽,進行修飾后的ShK-186對Kv1.3的IC 50為71±4 pM,對Kv1.1的IC50為7±0.5 nM,其選擇性約為97倍。而RTX-Ⅷ對Kv1.3的IC50為36 nM,對Kv1.1的IC50大于100mM,其選擇性大于3000倍,且RTX-Ⅷ為未經(jīng)任何修飾改構的天然多肽,其選擇性明顯要優(yōu)于ShK-186。2、ShK-186的修飾是在ShK的C端偶聯(lián)上酰胺化合物,在第23個氨基酸改為甲硫氨酸,在N端加上一個磷酸化的酪氨酸,所以其樣品的獲得一定得依賴化學合成獲得,而又因為本身含有三對二硫鍵,又要對合成的樣品進行二硫鍵的連接。而RTX-Ⅷ可以通過基因工程表達獲得大量的樣品。所以,在樣品的獲得上,RTX-Ⅷ具有比ShK-186更大的優(yōu)勢。綜上所述,本研究通過原核表達成功表達了Kv1.3的多肽抑制劑RTX-Ⅷ,并證明RTX-Ⅷ在EAE和牛皮癬動物模型中表現(xiàn)出很好的治療效果,首次闡述了Kv1.3與克羅恩疾病的關系,并證明了Kv1.3抑制劑在大鼠克羅恩疾病模型中表現(xiàn)出很好的治療效果,豐富了人們對克羅恩與Kv1.3的關系的認識。
【圖文】：

圖 1. Kv1.2 通道蛋白質晶體 X 射線衍射及三級結構。A：Kv1.2 通道蛋白質晶體 X 射線射。白色為晶格，，藍色顯示電子密度。B：Kv1.2 通道結構示意圖。紅色為 亞基，藍色為 基[27]。

圖 1. Kv1.2 通道蛋白質晶體 X 射線衍射及三級結構。A：Kv1.2 通道蛋白質晶體 X 射線射。白色為晶格，藍色顯示電子密度。B：Kv1.2 通道結構示意圖。紅色為 亞基，藍色為 基[27]。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R965;R-332

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 朱玉祜;;基于RTX的懸掛物管理系統(tǒng)實時測試設備設計[J];測控技術;2017年03期

2 張文輝;陳欣;曹立佳;鄭惠;;基于RTX的無人機地面站系統(tǒng)[J];兵器裝備工程學報;2017年09期

3 李寅龍;張新玉;張鳳;;基于RTX的步進電機壽命實驗[J];電子測量技術;2016年10期

4 張福凱;賈秋玲;韓圣潔;;基于RTX的無人機飛行剖面實時仿真[J];電子設計工程;2013年07期

5 孫繼紅;;RTX技術在半實物仿真中的應用及開發(fā)[J];計算機仿真;2010年08期

6 趙正偉;杜承烈;;基于實時網(wǎng)和RTX的分布虛擬試驗系統(tǒng)研究[J];計算機仿真;2007年10期

7 陳文佳;孟曉文;王麗娜;詹英;;脊髓膠質細胞在RTX誘導的神經(jīng)病理性疼痛大鼠的作用[J];江蘇醫(yī)藥;2017年12期

8 劉坤鵬;邢仁平;鞏稼民;;基于RTX的目標跟蹤算法性能評估系統(tǒng)[J];西安郵電大學學報;2016年01期

9 楊武;任德均;楊亮;;基于RTX鈔紙噴碼識別實時系統(tǒng)的研究[J];微型電腦應用;2011年02期

10 姜寶林;苗克堅;陸寅;;基于RTX的飛控快速控制原型仿真系統(tǒng)設計[J];計算機應用與軟件;2011年10期

相關會議論文 前10條

1 姚建勇;吳帥;尚耀星;焦宗夏;;RTX在半實物仿真中的時延問題及解決[A];第五屆全國流體傳動與控制學術會議暨2008年中國航空學會液壓與氣動學術會議論文集[C];2008年

2 胡勝海;徐鵬;潘胤卓;許偉科;;基于RTX的供彈系統(tǒng)控制軟件開發(fā)與試驗研究[A];2009年中國智能自動化會議論文集（第七分冊）[南京理工大學學報（增刊）][C];2009年

3 李兆熠;張金鎖;王延新;;基于RTX的半實物景象仿真系統(tǒng)設計[A];第十屆全國光電技術學術交流會論文集[C];2012年

4 閔春紅;劉理;華創(chuàng)錄;;一種基于RTX的實時動態(tài)紅外半實物仿真系統(tǒng)[A];2009系統(tǒng)仿真技術及其應用學術會議論文集[C];2009年

5 鄒鵬程;陳建華;齊杰斌;余威;宋錫友;;基于RTX的米巴赫焊機焊縫質量檢測系統(tǒng)的設計研究[A];中國計量協(xié)會冶金分會2013年會論文集[C];2013年

6 邱惠昌;張港;鄒建國;孟繁輝;;基于RTX與擴展串口通訊卡的實時測控系統(tǒng)設計[A];第二十七屆中國（天津）2013IT、網(wǎng)絡、信息技術、電子、儀器儀表創(chuàng)新學術會議論文集[C];2013年

7 遠菲;毛征;王哲;;基于RTX的自行高炮仿真系統(tǒng)研究[A];系統(tǒng)仿真技術及其應用學術論文集（第15卷）[C];2014年

8 徐智慧;黃邦高;諸靖宇;周鵬;倪慶節(jié);張心男;;阿米替林口服聯(lián)合RTX膀胱灌注治療感覺敏感性膀胱過度活動癥[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

9 徐智慧;黃邦高;諸靖宇;周鵬;倪慶節(jié);張心男;;阿米替林口服聯(lián)合RTX膀胱灌注治療感覺過敏性膀胱過度活動癥[A];2008年浙江省泌尿外科學術年會論文匯編[C];2008年

10 周鵬;張心男;倪慶節(jié);徐智慧;諸靖宇;黃邦高;龔秀清;;RTX及Cystat膀胱灌注治療男性慢性盆腔疼痛綜合征(CPPS)的臨床觀察[A];2006年浙江省泌尿外科學術會議論文匯編[C];2006年

相關重要報紙文章 前1條

1 李昆　陳小玲;六合地稅積極推進“直通車RTX”[N];江蘇經(jīng)濟報;2009年

相關博士學位論文 前1條

1 陳波;Kv1.3專一性抑制劑RTX-Ⅷ的結構與功能研究及應用探索[D];湖南師范大學;2019年

相關碩士學位論文 前10條

1 王亞菲;與RTX集成的科研成果管理系統(tǒng)的研究與實現(xiàn)[D];天津大學;2014年

2 王超;基于RTX的并聯(lián)機器人開放式控制系統(tǒng)研究[D];燕山大學;2015年

3 葉百勝;基于RTX的開放式數(shù)控系統(tǒng)研究[D];上海工程技術大學;2016年

4 張鋒;基于RTX的三軸轉臺控制系統(tǒng)研究[D];哈爾濱工程大學;2009年

5 趙郁峰;三軸轉臺的神經(jīng)網(wǎng)絡控制研究及基于RTX控制軟件設計[D];四川大學;2005年

6 杜圍;膀胱內(nèi)灌注RTX預防TURP術后膀胱過度活動癥[D];暨南大學;2005年

7 王丹;基于RTX與多核技術的自動分揀系統(tǒng)研究[D];上海交通大學;2012年

8 劉乾;基于RTX的復合信號處理器檢測儀檢測軟件的設計與實現(xiàn)[D];西安電子科技大學;2014年

9 郭麗瓊;胸膜肺炎放線桿菌RTX毒素與宿主細胞相互作用的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

10 呂海龍;基于RTX的無人機實時飛行仿真系統(tǒng)研究[D];南京航空航天大學;2015年

本文編號：2674466