【摘要】：帕金森病(Parkinson disease,PD)又稱(chēng)震顫性麻痹,是神經(jīng)退行性疾病,在世界范圍內(nèi)隨年齡的增加發(fā)病率大幅增加。其致病機(jī)理是中腦黑質(zhì)路易小體的堆積和多巴胺能神經(jīng)元的丟失以及紋狀體內(nèi)多巴胺含量的減少造成的黑質(zhì)—紋狀體通路遞質(zhì)的不平衡而形成的多種功能障礙。遺傳易感性、炎癥、環(huán)境因素、重金屬因素、頭部創(chuàng)傷以及細(xì)菌或者病毒的感染等均可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的凋亡而發(fā)生PD。研究已證實(shí)炎癥反應(yīng)在PD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,并且在疾病早期就已出現(xiàn),慢性炎癥導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路受損。在生理?xiàng)l件下,小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出靜息表型,時(shí)刻監(jiān)測(cè)其周邊環(huán)境。當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)到損害CNS穩(wěn)態(tài)的“危險(xiǎn)”信號(hào)時(shí),迅速活化�；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞樣的阿米巴狀,釋放大量促炎細(xì)胞因子和活性氧等神經(jīng)毒性物質(zhì),導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元凋亡。受損的多巴胺能神經(jīng)元反過(guò)來(lái)作為刺激因素進(jìn)一步刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,形成一個(gè)惡性循環(huán)的病理過(guò)程,導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變的持續(xù)發(fā)展。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),與線(xiàn)粒體的生物發(fā)生密切相關(guān)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的共激活因子1α(PGC-1α)具有顯著的細(xì)胞保護(hù)作用。本課題組前期研究結(jié)果顯示,通過(guò)攜帶有PGC-1α基因的慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,使其PGC-1α過(guò)表達(dá)能顯著抑制線(xiàn)粒體自噬,并提高M(jìn)PP~+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的存活;立體定位注射過(guò)表達(dá)慢病毒于小鼠的黑質(zhì)后,腹腔注射MPTP復(fù)制PD模型,發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而且小膠質(zhì)細(xì)胞激活顯著高于MPTP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M。因此,我們推測(cè)PGC-1α的過(guò)表達(dá)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的這一保護(hù)作用,除了直接對(duì)神經(jīng)元本身的作用外,可能與激活小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。本論文擬探討PGC-1α表達(dá)量的變化對(duì)炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,以及小膠質(zhì)細(xì)胞的極化與PD發(fā)生的關(guān)系,為揭示PD發(fā)生的機(jī)制和PGC-1α的神經(jīng)保護(hù)作用提供基礎(chǔ)研究資料。本研究以C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,立體定位注射構(gòu)建的過(guò)表達(dá)和干擾PGC-1α慢病毒至小鼠的黑質(zhì),飼養(yǎng)到29 d,以腹腔注射MPTP的方式復(fù)制PD小鼠亞急性模型。采用行為學(xué)方法檢測(cè)小鼠的PD癥狀,Western blot檢測(cè)TH、PGC-1α、IL-6蛋白在黑質(zhì)內(nèi)的表達(dá)情況,ELISA方法檢測(cè)血液中IL-6、IL-1β的含量變化,免疫熒光方法檢測(cè)TH、PGC-1α等陽(yáng)性細(xì)胞在黑質(zhì)內(nèi)的數(shù)量變化和小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)以及M1型標(biāo)記物iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Arg1(Arginase catalyzes 1,Arg1)在數(shù)量上的變化。通過(guò)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì),得到如下結(jié)果:1.MPTP組小鼠的黑質(zhì)內(nèi),Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和Iba1/PGC-1α雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)目顯著多于control組(P0.05)。在注射慢病毒的PGC-1α過(guò)表達(dá)及干擾組小鼠黑質(zhì)內(nèi),確認(rèn)其小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞被慢病毒所轉(zhuǎn)染。2.在PGC-1α過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,MPTP+LV-PGC-1α組與MPTP組比較,轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)顯著減少(P0.05)、潛伏期顯著增長(zhǎng)(P0.05);免疫熒光結(jié)果顯示,MPTP+LV-PGC-1α組較比MPTP組,黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.05);MPTP+LV-PGC-1α組小鼠的黑質(zhì)內(nèi)PGC-1α的蛋白表達(dá)量較比MPTP組和LV-EGFP組顯著升高(P0.05),血液中IL-1β的含量顯著增加(P0.05);MPTP+LV-PGC-1α組較比MPTP組,其TH表達(dá)量升高,但無(wú)顯著性差異(P0.05)。3.在PGC-1α干擾實(shí)驗(yàn)中,MPTP+LV-shRNA-PGC-1α組較比MPTP+LV-shRNA-EGFP組,小鼠的站立次數(shù)顯著減少(P0.05);MPTP+LV-shRNA-PGC-1α組與MPTP組及LV-shRNA-EGFP組比較,黑質(zhì)內(nèi)PGC-1α的蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.05),iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P0.05);MPTP+LV-shRNA-PGC-1α組與MPTP組相比較,血液中IL-6的含量顯著下降(P0.05);MPTP+LV-shRNA-PGC-1α組與MPTP組相比較,Arg1細(xì)胞數(shù)減少且有顯著差異(P0.05)。4.米諾環(huán)素聯(lián)合PGC-1α過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,MPTP+LV-PGC-1α+Mino組與MPTP+LV-PGC-1α組比較,小鼠中腦黑質(zhì)致密部區(qū)域的TH陽(yáng)性神經(jīng)元顯著增加(P0.05),黑質(zhì)部位Iba1細(xì)胞激活數(shù)目顯著減少(P0.05),小鼠中腦黑質(zhì)致密部區(qū)域的iNOS細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P0.05)。通過(guò)對(duì)上述結(jié)果的分析,得出如下結(jié)論:1.提高PD小鼠黑質(zhì)內(nèi)PGC-1α的表達(dá)量,能激活小膠質(zhì)細(xì)胞,由M1型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子增加;能部分地顯著改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)癥狀。2.降低PD小鼠黑質(zhì)內(nèi)PGC-1α的表達(dá)量,能顯著降低PD小鼠的自主活動(dòng),M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均顯著減少,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子的量顯著降低。3.抗炎藥物—米諾環(huán)素能顯著降低因PGC-1α過(guò)表達(dá)引起的黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量顯著增加。從上述結(jié)果和結(jié)論中可看出,黑質(zhì)PGC-1α過(guò)表達(dá)確實(shí)能激活小膠質(zhì)細(xì)胞,但未出現(xiàn)作者希望的抗炎的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的增加,而是促炎的M1型釋放的炎性因子增加了,炎癥反應(yīng)加強(qiáng)。從行為學(xué)和形態(tài)學(xué)檢測(cè)的結(jié)果看,提高黑質(zhì)PGC-1α的表達(dá)能顯著改善PD小鼠部分運(yùn)動(dòng)癥狀,對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用。這似乎提示PGC-1α的神經(jīng)保護(hù)作用不是通過(guò)增加M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能實(shí)現(xiàn)的,而是提升了多巴胺能神經(jīng)元自身的抗MPP~+損傷能力所導(dǎo)致。但鑒于被激活而增加的小膠質(zhì)細(xì)胞其分化時(shí)程的復(fù)雜性,本實(shí)驗(yàn)的取材時(shí)間點(diǎn)可能早于或晚于M1向M2型分化的時(shí)間,所以上述結(jié)論尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為提升PGC-1α的表達(dá)防治PD提供了部分基礎(chǔ)資料,但相關(guān)的機(jī)制還有待于后續(xù)的進(jìn)一步研究。
【圖文】：

TP（30 mg/kg）。(1) PD 動(dòng)物模型的復(fù)制參考《The Mouse Brian in Stereotaxic Coordinates》，確定注射位點(diǎn)，對(duì)一月齡小鼠（約-18 g）進(jìn)行黑質(zhì)立體定位注射。腹腔注射 10%的水合氯醛（大約 0.06-0.08ml），麻醉小鼠。等待大概 5min，掐小鼠尾待小鼠無(wú)反應(yīng)后固定小鼠于立體定位儀上。首先減去頭部的毛，再用蘸有酒精（75%）棉球擦頭部，，然后剪開(kāi)頭皮大概 0.3cm 左右，用棉球?qū)?nèi)腦膜擦掉，參考《The Mouse BrianStereotaxic Coordinates》，明確注射位點(diǎn)：Bregma 后 3 mm、旁開(kāi) 1.3 mm、深 4.5 mm。到注射點(diǎn)并標(biāo)記，保持顱骨鉆平穩(wěn)準(zhǔn)確的鉆開(kāi)注射點(diǎn)的頭骨后，插入微量進(jìn)樣器。插入程要緩慢（1min 左右），待整個(gè)進(jìn)樣系統(tǒng)穩(wěn)定后，開(kāi)始勻速注射，時(shí)間為 30 min。saline射完后，繼續(xù)等 15 min，小心別讓腦內(nèi)注射物倒流，緩慢勻速抽出，然后縫合頭皮。繼飼養(yǎng)小鼠于恒溫恒濕條件至 29 天進(jìn)行腹腔注射 MPTP/saline，持續(xù) 3 d。具體的時(shí)間表如。

結(jié)果如圖 2、3 顯示，空白對(duì)照組中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較少且呈狀態(tài)；MPTP 組中小膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活且數(shù)目增多，有些 Iba1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞樣，分布于黑質(zhì)致密部和網(wǎng)狀部；GFAP 標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞同樣表現(xiàn)激活現(xiàn)象質(zhì)致密部和網(wǎng)狀部 GFAP 熒光強(qiáng)度增加。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核與 PGC-標(biāo)，且 PGC-1α/Iba1 雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組顯著增多（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：河北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5;R-332

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