【摘要】：腎臟中腎小管和集合管對(duì)水的重吸收決定著機(jī)體的水平衡,而腎小管的小管液中溶質(zhì)所形成的滲透壓,是對(duì)抗水重吸收的力量。因此,腎臟對(duì)水和電解質(zhì)的重吸收和排泄是相互影響的過(guò)程,它們的平衡決定著腎臟功能的正常發(fā)揮。由于近端小管對(duì)水的重吸收是定比重吸收,而遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)水的重吸收是可調(diào)節(jié)的,該部位對(duì)水和電解質(zhì)的重吸收和排泄對(duì)機(jī)體的水平衡發(fā)揮著決定性作用,因此其調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的意義。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可以調(diào)控細(xì)胞形狀、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等細(xì)胞過(guò)程。有文獻(xiàn)表明,肌動(dòng)蛋白及其相關(guān)蛋白參與腎臟的水鹽代謝等各種功能的調(diào)節(jié)。在對(duì)血管加壓素處理的小鼠皮質(zhì)集合管頂端膜進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中,人們發(fā)現(xiàn)約100種蛋白發(fā)生顯著變化,其中20%與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān),這突出了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在調(diào)節(jié)水平衡中的重要作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),肌動(dòng)蛋白微絲(actin filament,F-actin)的一個(gè)蓋帽蛋白--原肌球調(diào)節(jié)蛋白1(Tropomodulin1,Tmod1)在腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管中特異表達(dá),但其作用還有待研究。目的:通過(guò)研究Tmod1腎臟特異性敲除對(duì)小鼠腎臟水重吸收功能的影響,分析腎臟中與Tmod1相關(guān)的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò),研究Tmod1對(duì)水通道蛋白及離子通道的影響,探討Tmod1對(duì)機(jī)體水平衡的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制。方法:1.利用免疫組化,確定Tmod1在小鼠腎臟中的表達(dá)和定位。2.構(gòu)建Tmod1 ~(flox/flox)小鼠,并將其與腎小管和集合管特異表達(dá)Cre基因的Ksp-Cre小鼠雜交,獲得Tmod1腎臟特異性敲除小鼠Tmod1 ~(flox/flox)/Ksp-Cre~+(簡(jiǎn)稱為T(mén)FK),用Tmod1 ~(flox/flox)/Ksp-Cre~-(簡(jiǎn)稱為T(mén)F)小鼠作為對(duì)照。利用PCR和蛋白免疫印跡對(duì)小鼠進(jìn)行鑒定。3.利用代謝籠測(cè)量并比較TF和TFK小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)、禁水和水負(fù)荷條件下的尿量、尿滲透壓;利用無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定儀測(cè)量?jī)煞N小鼠的血壓;利用生化分析,檢測(cè)尿液中的離子濃度,計(jì)算電解質(zhì)的排泄量。4.利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)TF和TFK小鼠血液中血管升壓素(AVP)的含量;向兩種小鼠腹腔注射AVP,收集并測(cè)量2小時(shí)后的尿量和尿滲透壓。5.分離TF和TFK小鼠的腎臟組織并提取蛋白,將其進(jìn)行質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)分析。對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并對(duì)部分蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。6.利用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡,檢測(cè)TF和TFK小鼠腎臟中水通道和離子通道表達(dá)。結(jié)果:1.免疫組化結(jié)果顯示,Tmod1在腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管表達(dá)。2.PCR和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,TFK小鼠的腎小管和集合管中Tmod1被敲除。3.代謝籠結(jié)果顯示,在基礎(chǔ)狀態(tài)下,TFK小鼠24小時(shí)尿量為0.81±0.14mL,顯著低于TF小鼠(1.59±0.12 mL,P0.01);其尿液滲透壓為5494±259 mOsm/kg,顯著高于TF小鼠的尿滲透壓(3843±106mOsm/kg,P0.01)。在禁水條件下,TFK小鼠的尿量為0.40±0.10 ml,亦明顯低于TF小鼠(0.93±0.18mL,P0.05);TFK小鼠的尿滲透壓為6512±977 mOsm/kg,顯著高于TF小鼠的尿滲透壓(3709±319mOsm/kg,P0.05)。在水負(fù)荷24小時(shí)的條件下,TFK小鼠尿量為8.50±0.85 mL,顯著低于TF小鼠(10.92±0.45 mL,P0.05),其尿滲透壓為878±145 mOsm/kg,顯著高于TF小鼠(492±16 mOsm/kg,P0.05)。血壓測(cè)量結(jié)果提示,TFK小鼠的收縮壓為97.9±0.8 mmHg,顯著高于TF小鼠(105.0±1.6 mmHg,P0.05)。4.TFK小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下24小時(shí)內(nèi),主要電解質(zhì)(包括Na~+、K~+、Cl~-、Ca~(2+)、P)和尿素的排泄量均較TF小鼠降低(P0.05)。5.ELISA檢測(cè)顯示,TFK小鼠血液中血管加壓素水平與TF小鼠無(wú)差異;兩種小鼠在注射AVP后,尿量均減少,尿滲透壓均升高。6.質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,與TF小鼠腎臟相比,在TFK小鼠腎臟中有83個(gè)差異表達(dá)(變化倍數(shù)2或0.5,P0.05)蛋白,其中13個(gè)上調(diào),70個(gè)下調(diào)。Gene Ontology分析顯示,差異表達(dá)基因與蛋白磷酸化、代謝過(guò)程、磷酸化過(guò)程和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程有關(guān),還與細(xì)胞外泌體、線粒體、溶酶體等細(xì)胞成分有關(guān)。7.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示,所篩選出的TGFβR2、SlC25A11和MTFP1等蛋白均在TFK小鼠腎臟中表達(dá)下調(diào)。8.qPCR和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與TF小鼠腎臟相比,TFK小鼠腎臟中AQP2、AQP4和氯離子通道CFTR的表達(dá)均顯著上調(diào)。結(jié)論:Tmod1的敲除能夠引起小鼠尿濃縮能力的改變,使小鼠表現(xiàn)出少尿、高滲尿和高血壓的特征,腎臟中Tmod1可以影響多種蛋白的表達(dá),參與調(diào)節(jié)腎臟的多種生物過(guò)程,特別是通過(guò)對(duì)水通道及離子通道的調(diào)節(jié),進(jìn)而影響機(jī)體的水平衡穩(wěn)態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R334.1

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