【摘要】：弓形蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,呈世界性分布,廣泛寄生于人和動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)。能夠感染所有溫血?jiǎng)游?包括人,引起人畜共患弓形蟲病。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,全世界約有3 0%的人感染弓形蟲。免疫功能正常的宿主感染弓形蟲后,一般表現(xiàn)出沒有明顯癥狀的感染情況。現(xiàn)在的研究表明,弓形蟲的這種隱性感染模式雖然沒有明顯的癥狀,但是能夠侵入宿主的神經(jīng)系統(tǒng),影響神經(jīng)細(xì)胞的功能,從而導(dǎo)致宿主腦損害,甚至精神疾病的發(fā)生�，F(xiàn)在,越來越多的證據(jù)表明弓形蟲慢性感染能影響神經(jīng)細(xì)胞損傷并參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。新近研究發(fā)現(xiàn),Non-coding RNA(ncRNA)是基因組中一類重要的非編碼RNA,不具有蛋白編碼功能,但是在生命過程中卻發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。其中長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)的長度大于200個(gè)核苦酸,作為神經(jīng)系統(tǒng)一類重要的非編碼RNA,通過與靶基因mRNA結(jié)合,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá),在許多神經(jīng)相關(guān)性疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在本研究中,我們用PRU株弓形蟲包囊經(jīng)口感染小鼠,建立弓形蟲慢性感染小鼠模型,通過微陣列芯片檢測lncRNA與mRNA在正常組與感染組的表達(dá)水平。通過熱圖、散點(diǎn)圖分析差異表達(dá)的lncRNA和mRNA,通過cis/trans預(yù)測靶基因?qū)Σ町惖膌ncRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測并進(jìn)行GO、KEGG富集分析,將相應(yīng)的基因根據(jù)功能的不同歸類,將有差異的pathway進(jìn)行富集,從而將相應(yīng)的基因進(jìn)行注釋及分類,找到實(shí)驗(yàn)條件下顯著性差異變化的生物學(xué)調(diào)控通路并確定研究的lncRNA及相應(yīng)靶基因。通過生物信息學(xué)方法對lncRNA進(jìn)行定位分析并確定核質(zhì)位置。通過實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)大樣本驗(yàn)證lncRNA及靶基因的表達(dá)。免疫組化、免疫熒光檢測感染弓形蟲慢性感染腦組織中蛋白的變化。利用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、克隆形成、TUNEL等實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上研究lncRNA的功能。通過構(gòu)建shRNA和過表達(dá)體系,研究lncRNA的表達(dá)變化對靶基因表達(dá)的影響,并通過Western blot檢測蛋白變化。此外,我們通過RNA Pull down實(shí)驗(yàn)將與lncRNA相關(guān)的蛋白拉下來,并通過質(zhì)譜分析,鑒定蛋白的種類,進(jìn)一步揭示lncRNA調(diào)控下游靶基因的機(jī)制。芯片數(shù)據(jù)顯示,感染弓形蟲的小鼠腦組織中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)發(fā)生了較大的變化,通過篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA11496在弓形蟲慢性感染腦組織中的表達(dá)差異變化較大。通過GO、KEGG富集分析,對lncRNA的靶基因和mRNA進(jìn)行基因注釋及分類,發(fā)現(xiàn)lncRNA11496和宿主精神行為的改變密切相關(guān);通過cis/trans預(yù)測了 lncRNA11496的基因,確定lncRNA11496靶基因是Mef2c。我們證實(shí)lncRNA11496定位于細(xì)胞核內(nèi)。同時(shí),我們通過qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),lncRNA11496和Mef2c都是下調(diào)的。我們通過熒光定量PCR檢測了干擾及過表達(dá)lncRNA11496以后,檢測相應(yīng)靶基因Mef2c的表達(dá)變化,結(jié)果顯示,lncRNA11496正向調(diào)控Mef2c的表達(dá)。同時(shí),我們通過Western blot檢測了蛋白水平上的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中,我們轉(zhuǎn)染shRNA干擾lncRNA11496及過表達(dá)lncRNA11496,通過CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾了 lncRNA11496以后,細(xì)胞增殖變得緩慢,而過表達(dá)lncRNA1 1496以后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖變快。我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞周期的變化,發(fā)現(xiàn)lncRNA的變化影響了細(xì)胞G1、G2和S期的占比,進(jìn)而影響了細(xì)胞的增殖情況。此外,我們還發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA1 1496的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而lncRNA11496表達(dá)增加能夠抑制細(xì)胞凋亡。通過RNA pull down及質(zhì)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)lncRNA1 1496是通過結(jié)合HDAC2來影響Mef2c的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化和凋亡。綜上所述,本研究通過微陣列芯片技術(shù)檢測了感染Ⅱ型弓形蟲后,小鼠腦內(nèi)lncRNA和mRNA的差異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)lncRNA11496差異表達(dá)顯著并與精神行為密切相關(guān),并且證明lncRNA11496是通過結(jié)合HDAC2來調(diào)控其靶基因Mef2c的表達(dá),進(jìn)而影響小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、周期及凋亡。進(jìn)一步闡明了lncRNA在弓形蟲慢性感染小鼠腦中的作用和調(diào)控機(jī)制,對弓形蟲對宿主神經(jīng)系統(tǒng)侵害的防治會開辟一個(gè)嶄新的方向。
【圖文】：

我們通過對差異表達(dá)的ＩｎｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ進(jìn)行熱圖分析，可以直觀顯示在逡逑慢性感染弓形蟲和正常小鼠腦組織中不同基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)共有１５００個(gè)逡逑ＩｎｃＲＮＡ的表達(dá)發(fā)生差異，其中６６２個(gè)上調(diào)，８３８個(gè)下調(diào)（圖１Ａ），有８６４個(gè)ｍＲＮＡ逡逑發(fā)生變化，３５６個(gè)上調(diào)，５０８個(gè)下調(diào)（圖１Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑－１．５邐０邐１．５邐－１．５邐０邐１．５逡逑■邋■逡逑ＥＸ１邋ＥＸ２邋ＥＸ３邋ＣＴ１邋ＣＴ２邋ＣＴ３邐ＥＸ１邋ＥＸ２邋ＥＸ３邋ＣＴ１邋ＣＴ２邋ＣＴ３逡逑圖１．熱圖分析感染組和未感染組小鼠腦組織中ＩｎｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ的差異表達(dá)逡逑Ａ．邋ＩｎｃＲＮＡ的表達(dá)水平；Ｂ．邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平。逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ｈｅａｔ邋ｍａｐｓ邋ａｎａｌｙｚｅ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＩｎｃＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｂｒａｉｎ邋ｏｆ逡逑ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＩｎｃＲＮＡ；邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍＲＮＡ．逡逑１７逡逑

一個(gè)而威爾直角坐標(biāo)系中。散點(diǎn)圖中Ｘ軸，Ｙ軸分別表示該點(diǎn)在對照及實(shí)驗(yàn)樣品逡逑芯片中處理的信號值。通過散點(diǎn)圖，進(jìn)一步分析了邋ＩｎｃＲＮＡ及ｍＲＮＡ在弓形蟲慢逡逑性感染小鼠腦組織中的差異變化（圖２Ａ，２Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１５邐１５逡逑？邋／逡逑ｉｏ邐，？？邐？？，邐１0逡逑P牛簀義希靛危保板危保靛危靛危保板危保靛義賢跡玻⒌閫擠治霾煌虻謀澩鎪藉義希粒澹桑睿悖遙危戀謀澩鎪劍唬攏澹恚遙危戀謀澩鎪�。辶x希疲椋紓玻澹鈴澹螅悖幔簦簦澹蟈澹穡歟錚翦澹幔睿幔歟澹簀澹簦瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹歟澹觶澹歟簀澹錚駑澹洌椋媯媯澹潁澹睿翦澹紓澹睿澹簀義希粒澹裕瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹歟澹觶澹戾澹錚駑澹桑睿悖遙危粒誨澹攏澹裕瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹歟澹觶澹戾澹錚駑澹恚遙危粒義希常危牽�、ＫＥ壳富集分析测犦灊惋的基蚁X義銜私徊椒治霾鉅轂澩锏模桑睿悖遙危漣謝蠔停恚遙危�，通过肯、ＫＥ壳富集辶x戲治霾鉅轂浠幕潁湊展δ艿牟煌泄槔啵鉅煜災(zāi)模穡幔簦瑁鰨幔�？行刚d義霞曰蚪兇⑹禿頭擲�，，磦蝤諛I(yè)教囟ㄊ笛樘跫虜鉅轂浠模穡幔簦瑁鰨幔＝徨義瞎允靜鉅轂澩锏模桑睿悖遙危漣謝虼蟛糠指患諫窬钚耘涮迨芴遄饔�，多巴胺辶x賢淮�、箘癖酸突触、神经细胞的X鮒撤只暗蟯齙刃藕磐罰ㄍ跡常�，邋３nｅ義喜鉅轂澩锏模恚遙危鏈蟛糠指患詰?yīng)代谢，趋化因讬熏｀嵟科信号通铝P評脲義獻(xiàn)有藕磐

本文編號：2658383