【摘要】：研究背景和目的寨卡病毒(ZIKV)是目前幾種新興的蟲(chóng)媒傳播病毒之一,1947年首次在烏干達(dá)寨卡森林發(fā)現(xiàn),同時(shí)也是巴西和波多黎各腦炎和胎兒小頭畸形暴發(fā)的原因。寨卡病毒可通過(guò)伊蚊傳播,但與其他蚊媒傳播的黃病毒(FVs)不同的是,寨卡病毒具有其獨(dú)特的特性,即可通過(guò)性傳播甚至導(dǎo)致持續(xù)性傳播(1至6個(gè)月)。2015年在美洲暴發(fā)流行的寨卡病毒已經(jīng)引發(fā)全球公共衛(wèi)生緊急狀況,據(jù)預(yù)測(cè),在美洲,每年可出現(xiàn)由寨卡病毒引起的400萬(wàn)例臨床病例。胎盤(pán)和血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)通常能阻止母體和胎兒血液的混合,并限制一些物質(zhì)進(jìn)入成人和胎兒的神經(jīng)細(xì)胞室。而寨卡病毒則是可以穿過(guò)這些細(xì)胞,進(jìn)而感染胎兒和母體。所感染的細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和Hofbauer細(xì)胞。據(jù)報(bào)道,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),同樣能在人和蚊子中共同傳播的登革病毒(DENVs)與寨卡病毒具有驚人的同源性。目前仍不清楚引發(fā)最近暴發(fā)流行和嚴(yán)重疾病的原因,迫切需要實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)解決這些關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題。新近研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路存在一定的聯(lián)系,而且MAPK-ERK信號(hào)通路目前仍然是目前的研究熱點(diǎn)。因此本課題主要研究ERK2抑制劑VX-11e抑制寨卡病毒的復(fù)制、增殖的機(jī)制。從而為臨床寨卡病毒病的藥物治療研究提供新的思路。研究方法1.VX-11e對(duì)寨卡病毒復(fù)制的影響寨卡病毒在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增和滴度測(cè)定后,感染HBMEC和Vero細(xì)胞。不同濃度的VX-11e作用于感染病毒的細(xì)胞后,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR,qPCR)等技術(shù)分別檢測(cè)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況,以及相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和核糖體S6蛋白激酶(RSK)的表達(dá)量,確定VX-1 1e對(duì)寨卡病毒復(fù)制的影響。2.RSK對(duì)寨卡病毒復(fù)制的影響運(yùn)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)對(duì)RSK和ERK進(jìn)行沉默后,檢測(cè)RSK和ERK的表達(dá)量,確證沉默相應(yīng)基因后RSK和ERK表達(dá)量減少。應(yīng)用qPCR技術(shù)對(duì)寨卡病毒的復(fù)制增殖量進(jìn)行檢測(cè),明確病毒復(fù)制與RSK和ERK表達(dá)量之間的關(guān)系。3.寨卡病毒NS5蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建運(yùn)用真核表達(dá)載體pEGFP-N1構(gòu)建寨卡病毒NS5蛋白表達(dá)載體。結(jié)果(1)寨卡病毒可以在HBMEC中擴(kuò)增,與新近的報(bào)道結(jié)果一致。尤其是ZIKV可以感染HBMEC,為ZIKV導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)感染解釋了跨越血腦屏障的途徑。(2)VX-11e在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)FHBMEC和Vero細(xì)胞無(wú)明顯毒性,對(duì)寨卡病毒具有明顯的抑制增殖的作用,具有濃度依賴(lài)性。這種抑制作用不影響病毒對(duì)細(xì)胞的粘附,主要是通過(guò)抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制作用。(3)VX-1 1e在mRNA和蛋白質(zhì)水平上具有抑制RSK表達(dá)的作用。(4)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抑制RSK的表達(dá)對(duì)病毒的復(fù)制具有抑制作用。(5)成功構(gòu)建pEGFP-NS5蛋白表達(dá)載體。(6)VX-11e對(duì)寨卡病毒全長(zhǎng)克隆Z0E2-GFP轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的寨卡病毒有抑制作用,而突變后Z0E2-mute不表達(dá)NS5蛋白,VX-11e對(duì)其抑制效果消失,重新加入pEGFP-NS5表達(dá)載體表達(dá)NS5蛋白后,抑制效果恢復(fù)。結(jié)論VX-11e通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)RSK的表達(dá),進(jìn)而影響寨卡病毒NS5蛋白,最終達(dá)到抑制寨卡病毒在細(xì)胞中復(fù)制的作用。通過(guò)本文的研究,為臨床寨卡病毒病的藥物治療研究提供新的思路線(xiàn)索。
【圖文】：

用自：Ａｎｊｕｍ邋Ｒ，Ｂｌｅｎｉｓ邋Ｊ邋（２００８）邋Ｔｈｅ邋ＲＳＫ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｏｆ邋ｋｉｎａｓｅｓ：邋ｅｍｅｒｇｉｎｇ邋ｒｏｌｅｓ邋ｉｎ邋ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．邋Ｎａｔ邋Ｒｅｖ邋Ｍｏｌ邋Ｃｅｌｌ邋Ｂｉｏｌ）逡逑ＲＳＫ的結(jié)構(gòu)是復(fù)雜的并且包含兩個(gè)功能不同的激酶結(jié)構(gòu)域，接頭區(qū)，以及逡逑Ｎ－和Ｃ－末端尾（圖１）。ＮＴＫＤ與ＡＧＣ家族的激酶（ＰＫＡ，ＰＫＧ，邋ＰＫＣ）具有逡逑同源性。Ｃ末端激酶結(jié)構(gòu)域（ＣＴＫＤ）與鈣／媽調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（ＣａＭＫ）逡逑同源。ＣＴＫＤ參與ＲＳＫ的自身磷酸化，ＮＴＫＤ負(fù)責(zé)底物磷酸化［２６，氣激酶結(jié)構(gòu)逡逑域通過(guò)保守的接頭區(qū)域連接。稱(chēng)為Ｄ結(jié)構(gòu)域的ＥＲＫ對(duì)接基序存在于Ｃ－末端尾逡逑部。ＲＳＫ與ＥＲＫ１邋／邋２的相互作用通過(guò)Ｄ結(jié)構(gòu)域中的特定基序（Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－逡逑ＡｒｇＡｒｇ）發(fā)生［４Ｇ］。Ｘ．ｌａｅｖｉｓ研究了邋ＥＲＫ和ＲＳＫ相互作用的功能關(guān)系，其中逡逑ＲＳＫ與無(wú)活性的ＥＲＫ相關(guān)；在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中激活ＥＲＫ后，ＲＳＫ與ＥＲＫ逡逑解離［４１］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ＲＳＫ１通過(guò)位于Ｄ結(jié)構(gòu)域附近的Ｓｅｒ殘基的自磷逡逑酸化從ＥＲＫ１／２解離

Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ＶＸ－ｌｌｅ邋ｔｏ邋ＨＢＭＥＣｓ邋ａｎｄ邋Ｖｅｒｏ邋ｃｅｌｌｓ逡逑１．４．２不同濃度的ＶＸ－ｌｌｅ作用于感染寨卡病毒的ＨＢＭＥＣ和Ｖｅｒｏ細(xì)胞逡逑如圖１－２至圖１－４所示，當(dāng)ＶＸ－ｌｌｅ在ＨＢＭＥＣ和Ｖｅｒｏ細(xì)胞中分別以０－２０逡逑ｐＭ邋和邋０－１５邋ｎＭ邋濃度作用于細(xì)胞時(shí)［ＨＢＭＥＣ：邋０邐（１±０．０３），５邋ｐＭ逡逑（０．９８２±０．１１１）邋，邋１０邋＼ｉＭ邋（０．６９３±０．２２１）邋，邋１５邋ｐＭ邋（０．０１１邋±０．００７邋），２０逡逑（０．００１４±０．０００９５）；邋Ｖｅｒｏ邋細(xì)胞：０邋ｎＭ邋（１±０．０４５），５邋ｊｉＭ邋（０．５０２±０．１２３），１０逡逑ｐＭ邋（０．１７３±０．０７１），，１５邋ｐＭ邋（０．０４２±０．０１）］明顯抑制了寨卡病毒的復(fù)制，且這逡逑種抑制作用具有濃度依賴(lài)性（趨勢(shì)性檢驗(yàn)，Ｐ＜０．０５）。但從結(jié)果中可看出，相同逡逑濃度分別作用于ＨＢＭＥＣ和Ｖｅｒｏ細(xì)胞時(shí)，起到的抑制效果不完全相同。在逡逑ＨＢＭＥＣ中，ＶＸ－ｌｌｅ濃度為５邋ｐＭ時(shí)，寨卡病毒ｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)量減少了逡逑２２．２％；而在Ｖｅｒｏ細(xì)胞中
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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