【摘要】：目的:利用干擾素誘導型MX-Cre在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除含有7個WD40 repeat的接頭蛋白RACK1(基因名Gnb2l1),分析這種小鼠模型對病毒的抗感染能力如何。通過流式細胞術檢測并分析在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1對造血干細胞、各譜系造血祖細胞的影響,分析RACK1缺失對造血干細胞的凋亡及增殖的影響。通過蛋白-蛋白相互作用分析探討RACK1調(diào)控造血干細胞的分子機制。方法:1.在Ⅰ型干擾素反應細胞中敲除RACK1的小鼠模型,用Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)表示,對照小鼠用Gnb2l1~(F/F)表示,課題組前期工作已經(jīng)建立相應模型。在正式實驗開始前,剪鼠尾鑒定基因型,以區(qū)分Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠腹腔注射Poly(I:C),以實現(xiàn)Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠的體內(nèi)誘導敲除。并通過WB鑒定在蛋白水平上是否敲除。2.腹腔注射Poly(I:C)后,Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠尾靜脈注射VSV,后取小鼠外周血以得到血清,檢測血清中的IFNβ。取肺和肝并稱重,分別計算肺/體重和肝/體重。通過流式細胞術檢測Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠脾和肝中I型干擾素主要產(chǎn)生細胞pDC和髓系細胞的表達情況。3.取小鼠股骨骨髓,通過流式細胞術分選造血干細胞、巨核細胞/紅細胞系祖細胞、粒細胞/巨噬細胞祖細胞、髓系細胞祖細胞、淋巴細胞系祖細胞和B淋巴細胞、髓系細胞、紅系細胞,通過Real-Time PCR檢測各個階段RACK1、c-Myc及N-Myc的基因表達水平,并通過多色熒光組化分析RACK1與造血干細胞的表面標記CD117是否為共定位關系。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠及Gnb2l1~(F/F)小鼠股骨石蠟切片進行HE染色分析骨髓的病理損傷情況。通過流式細胞術分析Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠的造血干細胞、各譜系造血祖細胞比例和絕對數(shù),RACK1缺失對造血干細胞的凋亡及增殖的影響。制備嵌合體小鼠驗證上述變化是否由于細胞的內(nèi)在缺陷所引起。流式細胞術檢測Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠造血干細胞中c-Myc和N-Myc的表達量,并給小鼠腹腔注射Myc inhibitor進行逆轉(zhuǎn)實驗。為接下來的機制探討提供基礎。4.基于上述實驗基礎,進行體外實驗,免疫共沉淀(CO-IP)分析c-Myc、N-Myc分別與RACK1是否有相互作用。使用純化的GST及GST-RACK1直接pull down,分析是否為兩者的直接相互作用。純化Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠及Gnb2l1~(F/F)小鼠造血干細胞,沉淀c-Myc或N-Myc,來分析E3泛素連接酶Fbxw7在其中產(chǎn)生的作用。結果:1.小鼠基因型鑒定成功。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠在Poly(I:C)誘導后蛋白水平上也實現(xiàn)敲除。2.VSV感染后,與Gnb2l1~(F/F)小鼠相比,Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠血清中的IFNβ水平降低,肝肺濕重/體重比值有增高趨勢。流式細胞術檢測結果顯示Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠肝脾中Ⅰ型干擾素主要產(chǎn)生細胞pDC明顯少于Gnb2l1~(F/F)小鼠,并且髓系細胞也明顯低于Gnb2l1~(F/F)小鼠。3.Real-Time PCR結果顯示,在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上,造血干細胞、各譜系造血祖細胞及成熟階段細胞都含有RACK1、c-Myc和N-Myc。從數(shù)據(jù)上來看,幼稚階段表達水平明顯高于成熟階段。通過Gnb2l1~(F/F)小鼠股骨石蠟切片進行多色熒光組化的結果顯示RACK1與CD117具有熒光共定位。將Gnb2l1~(F/F)小鼠及Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠股骨石蠟切片進行HE染色分析,在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1使骨髓腔內(nèi)造血細胞稀少。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠中造血干細胞、CMP和CLP在細胞比例上和細胞總數(shù)上都顯著減少,GMP及MEP在絕對數(shù)統(tǒng)計結果中有明顯降低。HSC的凋亡及增殖在比例上都顯著增多。嵌合體小鼠實驗證明以上變化是由于小鼠細胞內(nèi)在缺陷所引起。Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1會使HSC中表達c-Myc和N-Myc的細胞比例增多。注射Myc inhibitor可以部分逆轉(zhuǎn)HSC。4.CO-IP結果顯示,RACK1與c-Myc、N-Myc之間都有相互作用,并且證明為直接相互作用。純化的小鼠造血干細胞沉淀c-Myc或N-Myc,結果顯示在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1后,c-Myc或N-Myc與E3泛素連接酶Fbxw7的相互作用減弱。結論:1.小鼠模型鑒定成功,區(qū)分出Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠;2.在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1使小鼠的抗感染能力減弱;3.在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1使骨髓中的HSC和各譜系造血祖細胞大幅度減少。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠的HSC凋亡比例顯著增加,增殖也大幅增加。制備嵌合體小鼠證實了這種現(xiàn)象為細胞內(nèi)在缺陷所引起。逆轉(zhuǎn)實驗提示我們在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1使骨髓中HSC產(chǎn)生一系列影響是由于c-Myc和N-Myc大量積聚所致;4.RACK1與c-Myc和N-Myc都具有直接相互作用,沉淀c-Myc或N-Myc,在Ⅰ型干擾素反應細胞中特異敲除RACK1后,與c-Myc或N-Myc相互作用的Fbxw7蛋白量減少。c-Myc或N-Myc與Fbxw7相互結合作用減弱,導致c-Myc或N-Myc大量積聚。為以后深入研究RACK1影響HSC的機制提供有利參考。
【圖文】：

細胞分化產(chǎn)生紅細胞、粒細胞、單核細胞和血小板[2]（圖1）。圖 1 造血干細胞的發(fā)育過程Fig 1 Development of hematopoietic stem cells7

[18-20]。生理情況下構成維持HSC的復雜網(wǎng)絡，，調(diào)控HSC的分化、擴增、運動及凋亡（圖2）[21]。在眾多類型的成體干細胞中，造血干細胞是研究歷史最長、認識最為深入、也是最早應用于臨床而且被公認有臨床治療效果的一類干細胞。8
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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