【摘要】：目的:瘧疾是一種經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲(chóng)所引起的全球性蟲(chóng)媒傳染病,約34億人存在著感染的風(fēng)險(xiǎn),目前仍有九十多個(gè)國(guó)家存在著瘧疾,腦瘧是瘧疾最嚴(yán)重的并發(fā)癥。在撒哈拉以南非洲地區(qū)兒童發(fā)病率及病死率高,營(yíng)養(yǎng)不良被公認(rèn)是其重要的影響因素之一。近來(lái)的研究表明,維生素D(Vitamin D,VD)不足在非洲地區(qū)是一個(gè)常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)不良問(wèn)題,公眾會(huì)誤認(rèn)為VD的缺乏應(yīng)該只發(fā)生在赤道南北緯35度以上的區(qū)域范圍,而在非洲地區(qū)生活的人群多靠近赤道,由于得到充足的光照,不會(huì)存在VD不足的情況。但現(xiàn)實(shí)的研究表明,即使在日照充足的地區(qū),也存在著VD缺乏的問(wèn)題。除了光源性維生素D來(lái)源外,食源性維生素D的缺乏可能是另一個(gè)重要的因素�；加兄匕Y瘧疾兒童的血清VD水平顯著低于健康人群的兒童。目前越來(lái)越多的科研工作者開(kāi)始關(guān)注維生素D的基礎(chǔ)研究,認(rèn)為其可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮其抗感染作用。人類腦型瘧疾的分子及細(xì)胞機(jī)制主要包括促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的上升、NF-κB通路引起內(nèi)皮激活導(dǎo)致細(xì)胞粘附因子的上調(diào),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化及感染紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板在腦毛細(xì)血管的隔離。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)鈣三醇在體外具有抗瘧疾能力。有研究報(bào)告稱,在感染伯氏瘧原蟲(chóng)的小鼠中,感染后治療性使用維生素D可使小鼠感染腦型瘧疾的感染率和死亡率降低。為此,我們根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and agriculture organization of the united natio,FAO)數(shù)據(jù)庫(kù)、美國(guó)農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)庫(kù)(United States Department of Agriculture,USDA)、全球疾病負(fù)擔(dān)網(wǎng)站(Global Burden of Disease,GBD),系統(tǒng)地進(jìn)行了非洲38個(gè)國(guó)家主要的7種食物消費(fèi)維生素D水平與非洲瘧疾病死率(Death)、傷殘調(diào)整生命年(Disability Adjusted of Life,DALY)、死亡損失壽命年(Years of Life Lost,YLL)、傷殘損失壽命年(years lived with disability,YLD)關(guān)系的研究;預(yù)防性補(bǔ)充VD對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)X瘧模型(Experimental cerebral malaria,ECM)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制和VD對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制研究,旨在為瘧疾的有效防治提供新的理論依據(jù),從而制定更為有效的抗瘧策略。研究方法:1.非洲撒哈拉以南38個(gè)國(guó)家食物消費(fèi)維生素D水平計(jì)算非洲38個(gè)國(guó)家7種食物成分中VD含量,得出各國(guó)食物消費(fèi)量日人均維生素D量。以此與各國(guó)瘧疾DALY進(jìn)行相關(guān)分析,并分為高低劑量組進(jìn)行比較分析。2.小鼠感染及原蟲(chóng)血癥觀察通過(guò)腹腔注射1×10~6P.b ANKA寄生的紅細(xì)胞(pRBC)感染小鼠,感染后每日取尾靜脈血涂片,Giemsa染液染色,鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。每日觀察小鼠的生存情況和狀態(tài),以及是否患有腦瘧。3.小鼠VD處理C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組,分別為正常小鼠未感染組(uninfected),PbA感染組(PbA),PbA感染對(duì)照組(油+PbA),Pb感染前預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)。Pb感染前預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)在小鼠感染PbA前五天起每日灌胃給予VD(50μg/kg),同時(shí),PbA感染對(duì)照組(油+PbA)在VD給藥相同時(shí)間點(diǎn)給予相同體積的大豆油。4.小鼠血腦屏障通透性檢測(cè)小鼠感染第五天后各組取小鼠尾靜脈注射200μl2%伊文思藍(lán)染料。一小時(shí)后,心臟灌注生理鹽水,處死小鼠后立即取腦并拍照。將小鼠的腦放入離心管中,每管加入2ml甲酰胺,孵育后離心,取上清液200μl,置于96孔板中,檢測(cè)波長(zhǎng)為630nm的吸光度并計(jì)算EB含量。5.巨噬細(xì)胞RAW264.7體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為只加入培養(yǎng)基的Normol組;只加入有效濃度VD的VD組(濃度為10nM);只加入LPS(1μg/ml)的LPS組為對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組VD+LPS組中每孔分別加入10nM的VD,再加入1μg/ml的LPS。每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48小時(shí)后分別收上清及細(xì)胞。6.RNA提取及Real-time RT-PCR取腦、脾及巨噬細(xì)胞RAW264.7提取RNA,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒去除殘存的基因組DNA后,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用得到的cDNA產(chǎn)物作為模板,進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。采用2~(-ΔΔCT)法量化各個(gè)分組的相對(duì)基因表達(dá)情況。7.ELISA檢測(cè)取小鼠血清、脾培養(yǎng)上清、腦、巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(RD Systems,Minneapolis,MN,USA)進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。8.流式細(xì)胞術(shù)制備小鼠脾細(xì)胞、腦細(xì)胞、巨噬細(xì)胞單細(xì)胞懸液,染色后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),Flowjo軟件分析。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間數(shù)據(jù)用Prism7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組均數(shù)的單因素方差分析(ANOVA),組間比較用q檢驗(yàn),標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析組內(nèi)和組間均值差異,采用Kaplan Meyer方法進(jìn)行生存期分析。P0.05為顯著差異。結(jié)果:1.非洲兒童處于維生素D嚴(yán)重不足的狀態(tài)非洲38個(gè)國(guó)家平均食物消費(fèi)維生素D水平很低。各國(guó)平均食物消費(fèi)維生素D與DALY、Death、YLL具有顯著負(fù)相關(guān)。30國(guó)家維生素D平均值低于2μg(80IU)/day以下,遠(yuǎn)低于WHO推薦水平。只有8國(guó)高于5μg/day。以此將各國(guó)維生素D劃分兩組進(jìn)行比較分析,DALY、YLL和YLD均具有顯著性差別。2.預(yù)防性補(bǔ)充顯著升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D_3水平感染后第5天,處死小鼠取血清檢測(cè)小鼠血清中VD含量。結(jié)果顯示,PbA感染組(PbA)及預(yù)防性使用VD組(VD+PbA)的小鼠VD水平可見(jiàn)顯著差異,且個(gè)體之間差異較大。3.預(yù)防性補(bǔ)充VD顯著防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的發(fā)生PbA感染組與PbA感染對(duì)照組(油+PbA)在小鼠癥狀、生存期、腦瘧發(fā)生率、原蟲(chóng)血癥等方面并無(wú)差異,但與預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)相比,在各方面均可見(jiàn)顯著差異。4.預(yù)防性補(bǔ)充VD顯著改善實(shí)驗(yàn)性腦瘧的病理改變PbA感染組(PbA)血腦屏障完整性明顯破壞,有很明顯的EB外滲,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)只可見(jiàn)少量EB外滲。5.預(yù)防性補(bǔ)充VD可顯著減少T細(xì)胞向腦組織遷移感染第5天,兩組小鼠腦組織的CXCR3、CXCL9和CXCL10均可見(jiàn)明顯升高。預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)顯著降低了腦組織中趨化因子CXCR3、CXCL9及CXCL10的表達(dá)。6.預(yù)防性補(bǔ)充VD抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答,降低IFN-γ、TNF-α水平預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)小鼠脾細(xì)胞中Th1型細(xì)胞所占比例明顯降低。在血清及脾培養(yǎng)上清中,感染后第5天,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)的IFN-γ和TNF-α表達(dá)量與PbA感染組(PbA)相比顯著降低。與PbA感染組(PbA)相比,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA表達(dá)水平及小鼠腦細(xì)胞IFN-γ和TNF-α的mRNA表達(dá)水平亦可見(jiàn)明顯的降低。7.預(yù)防性使用VD提高Tregs數(shù)量并增加IL-10、TGF-β分泌感染第3天,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)脾細(xì)胞中Tregs的數(shù)目明顯低于PbA感染組(PbA)脾細(xì)胞中Tregs的數(shù)目。與PbA感染組(PbA)相比,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)小鼠血清TGF-β及脾培養(yǎng)上清IL-10及TGF-β的水平在感染后第5天顯著高于PbA感染組(PbA)。8.預(yù)防性使用VD抑制DC的分化、成熟及活化在小鼠感染后第5天,PbA感染組(PbA)髓樣DCs(mDCs)和漿樣DCs(pDC)數(shù)量及比例略高于預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA),與PbA感染組(PbA)相比,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)DCs共刺激分子MHC-II的比例表達(dá)略有降低。9.預(yù)防性使用VD抑制分泌IL-1、IL-6、IL-12數(shù)據(jù)顯示,在感染PbA第3、5天,與PbA感染組(PbA)相比,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)血清、脾上清的IL-1、IL-6、IL-12水平及脾IL-1、IL-6、IL-12的mRNA表達(dá)水平均有明顯的減少。對(duì)體外巨噬細(xì)胞RAW264.7的刺激也顯示出相似的結(jié)果。10.預(yù)防性使用VD抑制NF-κB表達(dá)預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)脾細(xì)胞NF-κB的mRNA表達(dá)水平顯著減少。11.VD可抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4、TLR9及CD40的表達(dá)與LPS組相比,VD+LPS組CD40、TLR4、TLR9表達(dá)水平明顯下降,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)TLR4及TLR9的mRNA表達(dá)水平與LPS組相比顯著下降。12.VD可抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7 Th1型炎癥因子的釋放VD+LPS組TNF-α的表達(dá)水平與LPS組相比明顯降低。除此之外,VD+LPS組的TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低。13.VD可抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激作用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,LPS刺激可使巨噬細(xì)胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表達(dá)水平顯著上升,發(fā)現(xiàn)CD80、CD86的表達(dá)水平VD+LPS組與LPS組相比明顯降低,預(yù)防性補(bǔ)充VD組(VD+PbA)MHC-II的mRNA表達(dá)水平與LPS組有顯著下降。結(jié)論:非洲38個(gè)國(guó)家來(lái)自食物消費(fèi)的人均維生素D水平很低,平均值也僅僅是可達(dá)4μg/日人均消費(fèi)維生素D。而30個(gè)國(guó)家的日人均消費(fèi)維生素D不足2μg(80IU)以下。遠(yuǎn)低于WHO推薦的5μg(200IU)和美國(guó)醫(yī)學(xué)研究院推薦1-70歲人群的維生素D每日攝入量為15μg(600 IU),70歲及以上為20μg(800IU)。這足以證明,在非洲兒童處于維生素D嚴(yán)重不足的狀態(tài)。我們對(duì)維生素D與DALY的研究結(jié)果表明,維生素D是瘧疾的保護(hù)因素。預(yù)防性補(bǔ)充VD可顯著防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的發(fā)生,降低小鼠的死亡率,改善實(shí)驗(yàn)性腦瘧的病理改變。VD可抑制DC的分化、成熟及活化,影響脾臟DCs數(shù)量,減少巨噬細(xì)胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表達(dá),進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗原提呈功能。VD還可抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7TLR4、TLR9及CD40的表達(dá),減少NF-κB通路的作用,并抑制巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、IL-12及Th1型炎癥因子TNF-α,進(jìn)一步減少抗原提呈細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激作用。預(yù)防性補(bǔ)充VD可抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答,提高Tregs數(shù)量并增加IL-10、TGF-β分泌,抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。除此之外,預(yù)防性使用VD抑制NF-κB表達(dá),也可進(jìn)一步抑制炎癥反應(yīng)。從而減少腦中趨化因子CXCL9、CXCL10和粘附分子ICAM-1、VCAM-1,的表達(dá),進(jìn)而降低CD8~+T細(xì)胞在腦中的積聚,改善血腦屏障的完整性,最終防止腦瘧的發(fā)生。
【圖文】：

圖 1 非洲 38 個(gè)國(guó)家 7 種食物累加日人均維生素 D 經(jīng)年變化示 Congo 等 8 個(gè)國(guó)家的日人均 VD 量較高，均在 4μg 以上，其中 Gabon 最高，其高達(dá) 10μg；Namibia 等 30 個(gè)國(guó)家的日人均 VD 量偏低，均在 4μg 以下，其中 Sier3 年開(kāi)始呈上升趨勢(shì)。為了清晰地描述非洲 38 個(gè)國(guó)家食物消費(fèi)維生素 D 集中水平國(guó)食物消費(fèi)維生素 D 水平所在年份升序排列（不擴(kuò)展），再將 38 個(gè)國(guó)家按 8 和求各組均值，，產(chǎn)生圖 2。

圖2兩組不同食物消費(fèi)維生素D水平經(jīng)年Y 化
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 馬曉峰;劉曉菊;曾曉麗;;維生素D對(duì)慢性阻塞性肺疾病的影響[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2014年11期

2 Xiao-Rong Xu;Chang-Qin Liu;Bai-Sui Feng;Zhan-Ju Liu;;Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年12期

3 宋淑軍;劉俊麗;徐冰心;王曉菲;王宗燁;譚小青;司少艷;;維生素D對(duì)糖皮質(zhì)激素免疫抑制模型小鼠免疫功能的影響[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年23期

4 關(guān)莎莎;劉全忠;;維生素D_3的作用機(jī)制及在抗感染中的作用[J];皮膚性病診療學(xué)雜志;2011年03期

5 吳革平;章如新;;三種脂溶性維生素的免疫調(diào)節(jié)作用及其研究進(jìn)展[J];國(guó)際免疫學(xué)雜志;2008年02期

6 盧航青;鄭杰;;全反式維甲酸和1α,25二羥維生素D_3對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用[J];癌癥;2006年12期

7 祁曉平;黎介壽;李培;李剛;孫正;吳曉宇;;1,25-二羥維生素D_3對(duì)Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答大鼠免疫功能的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年11期

8 黃愛(ài)萍;維生素D缺乏性佝僂病的免疫功能研究[J];實(shí)用兒科臨床雜志;1996年02期

本文編號(hào)：2618360