發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 17:11

【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNAa和RNAi技術(shù)在裸鼠肝癌HepG 2腫瘤模型上,通過(guò)上調(diào)p21基因表達(dá),下調(diào)MTH 1基因表達(dá),在動(dòng)物整體水平研究對(duì)肝癌HepG 2腫瘤的抑制作用,為肝癌治療提供新的治療策略。方法:首先在體外培養(yǎng)肝癌HepG 2細(xì)胞,當(dāng)HepG 2細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),將HepG2腫瘤細(xì)胞注射在裸鼠右前肢腋下以建立種植瘤裸鼠動(dòng)物模型。將荷瘤成功的裸鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(CT)、saRNA-p21轉(zhuǎn)染組(P21)、siRNA-MTH 1轉(zhuǎn)染組(MTH1)和雙轉(zhuǎn)染聯(lián)合組(P21+MTH 1),每組6只。腫瘤動(dòng)物模型建立成功后在瘤旁注射給藥,三天一次,每鼠每次19.8μg,持續(xù)給藥30天。給藥期間觀察各組裸鼠的生活狀況、腫瘤體積變化以及生存時(shí)間。給藥結(jié)束后,取下腫瘤組織進(jìn)行脫水包埋,制備成冰凍切片。通過(guò)HE染色法觀察各組腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的病理形態(tài),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組p21和MTH 1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)情況;免疫熒光方法檢測(cè)各組腫瘤組織中P21、MTH 1蛋白的表達(dá);Western blot和ELISA方法檢測(cè)各組腫瘤組織中P21、MTH 1以及凋亡相關(guān)蛋白Bak、Caspase-3的相對(duì)表達(dá)水平;同時(shí)建立裸鼠肝癌HepG 2腫瘤模型進(jìn)行RNAs與順鉑藥的藥效對(duì)比研究,將荷瘤成功的裸鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(CT)、雙轉(zhuǎn)染組(P21+MTH 1)、順鉑組,每組6只。腫瘤動(dòng)物模型建立成功后在瘤旁注射給藥,三天一次,RNAs和順鉑藥每鼠每次40μg,持續(xù)給藥30天。給藥期間觀察各組裸鼠的生活狀況、腫瘤體積變化以及生存時(shí)間。結(jié)果:肝癌HepG 2腫瘤裸鼠動(dòng)物模型成功建立,成瘤率均為100%,裸鼠的生存率為100%;腫瘤體積增長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,P21組、MTH 1組腫瘤體積增長(zhǎng)速度低于CT組,P21+MTH 1組差異更為顯著;qPCR和WB結(jié)果顯示,體內(nèi)轉(zhuǎn)染靶向p21基因的saRNA和靶向MTH 1基因的siRNA后,轉(zhuǎn)染組相比對(duì)照組,p21的mRNA水平和蛋白水平顯著升高,MTH 1的mRNA水平和蛋白水平顯著降低,聯(lián)合轉(zhuǎn)染組差異更為顯著。ELISA結(jié)果顯示,聯(lián)合雙轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中Bak蛋白表達(dá)量增加,而單轉(zhuǎn)染組則無(wú)明顯變化。另外,Caspase-3蛋白在轉(zhuǎn)染RNAs的實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)均有所升高,且雙轉(zhuǎn)染組表達(dá)量明顯高于單轉(zhuǎn)染組。藥效實(shí)驗(yàn)的腫瘤體積增長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組,順鉑組與雙轉(zhuǎn)染組對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)有類(lèi)似的抑制作用,且雙轉(zhuǎn)染組小鼠存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于順鉑組。結(jié)論:上調(diào)p21基因和下調(diào)MTH 1基因表達(dá)可有效抑制HepG 2腫瘤的生長(zhǎng)。p21和MTH 1基因表達(dá)的共同調(diào)節(jié)作用比僅調(diào)節(jié)MTH 1或p21基因表達(dá)時(shí)抑制效果更為顯著。此外,siRNA靶向p21基因與saRNA靶向MTH 1基因的聯(lián)合調(diào)控可誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡,其機(jī)制有可能與Bak/Bcl-xl凋亡途徑中Bak的表達(dá)升高有關(guān)。且聯(lián)合調(diào)控癌基因表達(dá)效果優(yōu)于單一調(diào)控。藥效對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在治療過(guò)程中RNAs藥物與順鉑藥物相比治療效果類(lèi)似,但對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的的毒副作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小得多。
【圖文】：

3.1 荷瘤小鼠一般生理情況觀察裸鼠在接種 HepG 2 細(xì)胞后生存狀況良好，飲食正常，6 天后所有小鼠塊，測(cè)量腫瘤體積后均達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)（>100 mm3），成瘤率 100%，組間無(wú)顯隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，，單轉(zhuǎn)染 saRNA-p21/siRNA-MTH 1 組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度轉(zhuǎn)染 saRNA-p21+siRNA-MTH 1 組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比更為緩后期，對(duì)照組小鼠逐漸出現(xiàn)食欲不振、精神下降、活動(dòng)異常等現(xiàn)象。3.2 siRNA 和 saRNA 給藥對(duì)小鼠腫瘤體積、質(zhì)量和生存率的影響給藥 30 天后對(duì)比各組裸鼠腫瘤的體積大小、重量以及生長(zhǎng)速度。轉(zhuǎn)染大小明顯小于對(duì)照組，雙轉(zhuǎn)染組差異更為顯著（圖 1 A）。轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤比對(duì)照組明顯降低，雙轉(zhuǎn)染組差異更為顯著（圖 1 B）。轉(zhuǎn)染組腫瘤重量明組，雙轉(zhuǎn)染組差異更為顯著（圖 1 C）。對(duì)照組的腫瘤體積及腫瘤重量與轉(zhuǎn)存在明顯的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中 saRNA-p21+siRNA-MTH的效果尤為明顯。結(jié)果如下圖所示：

青島大學(xué)*士學(xué)位論文Fig. 1 A contrast image of tumor size, B contrast image of tumor growth rate and C ctumor weight after dissection.The results showed that RNAs could significantly inhibit tHepG 2 tumors in nude mice.3.3 HE 染色法觀察腫瘤組織的細(xì)胞形態(tài)分析 HE 染色結(jié)果得出，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)嚴(yán)重，雙轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比更為嚴(yán)重。如圖 2 所示：圖 2
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7;R-332

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本文編號(hào)：2613470