【摘要】：白介素-1受體輔助蛋白(Interleukin-1 Receptor Accessory Protein,IL1RAP)是參與白介素-1家族因子多種信號傳導(dǎo)途徑的共受體。其中,IL1RAP在慢性髓性白血病的干細(xì)胞表達(dá),但在正常造血干細(xì)胞中不表達(dá);在急性髓性白血病和骨髓增生異常綜合征患者的原始細(xì)胞上,IL1RAP的表達(dá)量也顯著增加。IL1RAP已被證明可作為多種癌癥的細(xì)胞表面標(biāo)志物,尤其是血液癌癥。因此,以IL1RAP為靶點(diǎn)開發(fā)抗體藥物治療白血病具有樂觀前景。利用柔性多肽鏈將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)連接形成單鏈抗體(scFv),既保留了與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單元又降低了免疫排斥反應(yīng),在免疫治療領(lǐng)域極具應(yīng)用優(yōu)勢。本課題綜合利用噬菌體展示技術(shù)和酵母表面展示技術(shù)從人源化的單鏈抗體庫中篩選針對IL1RAP靶點(diǎn)的單鏈抗體,并分析其特性。我們首先利用鏈霉親和素與生物素結(jié)合的原理,將人源單鏈抗體庫經(jīng)過2輪噬菌體淘選,利用ELISA檢測確定2輪淘選后的抗體庫具有明顯的陽性富集。富集的噬菌粒載體經(jīng)酶切純化獲得scFv片段,構(gòu)建成為酵母展示亞文庫。利用Aga1-Aga2的酵母展示系統(tǒng)經(jīng)過3輪酵母表面展示及流式細(xì)胞分選,逐級富集高親和力的單鏈抗體。篩選獲得的IL1RAP單鏈抗體片段經(jīng)DNA測序確定其序列。將篩選得到的IL1RAP單鏈抗體DNA克隆到pFuse載體,利用293F細(xì)胞表達(dá)含F(xiàn)c段的scFv蛋白。單鏈抗體經(jīng)protein A蛋白柱親和層析純化。同時(shí),我們利用CRISPR-Cas9編輯技術(shù)敲除IL1RAP,獲得了不表達(dá)IL1RAP的293F穩(wěn)定細(xì)胞株。利用IL1RAP敲除株和野生型293F細(xì)胞驗(yàn)證候選單鏈抗體結(jié)合IL1RAP的特異性,最終獲得2個(gè)具有較高親和力的IL1RAP單鏈抗體序列。綜上,本課題通過噬菌體和酵母展示篩選技術(shù)獲得了針對IL1RAP靶點(diǎn)的單鏈抗體,證實(shí)篩選得到的單鏈抗體與IL1RAP具有良好的親和力。為靶向IL1RAP蛋白的白血病等疾病免疫治療奠定了良好基礎(chǔ)。
【圖文】：

細(xì)介紹了 IL-1R 家族的 10 種受體的命名以及作用機(jī)制，，IL-1α、I 以及 IL1RAP 引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)；IL-18 結(jié)合 IL-1R7 引發(fā)炎癥反應(yīng)4、IL1RAP 引發(fā)炎癥反應(yīng)；IL-36α、IL-36β、IL-36γ 結(jié)合 IL-1R6 與 應(yīng)。族的促炎性因子（除 IL-18），在進(jìn)行信號傳導(dǎo)過程中，首先與細(xì)結(jié)合形成受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，但此時(shí)并不具備向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的能表面的共有結(jié)構(gòu)白介素-1 受體輔助蛋白（IL1RAP，又稱 IL-）形成異源三聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)而進(jìn)行信號傳遞，引發(fā)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5]（

刺激小鼠后并沒有產(chǎn)生人們預(yù)期的特異性抗體[14]。這些問題的存在單鏈抗體的研究與開發(fā)�？贵w分子由 4 條多肽鏈構(gòu)成，包括 2 條重鏈和 2 條輕鏈，鏈與鏈之當(dāng)完整的抗體分子經(jīng)木瓜蛋白酶消化后，得到兩個(gè)完整的抗原結(jié)合由重鏈恒定區(qū) 2 和 3 組成的 Fc 段。Fab 片段還能夠通過酶解的方結(jié)構(gòu)單位 Fv。Fv 片段由抗體分子的重鏈可變區(qū)（VH）與輕鏈可變價(jià)鍵連接，是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單元。而單鏈抗體因工程的手段得到的，它是利用一個(gè)柔性的多肽鏈將抗體分子的重變區(qū)連接在一起，并且這條多肽鏈需包括至少 12 個(gè)氨基酸殘基，體與抗原結(jié)合的三維構(gòu)象[15]。最常用的連接肽鏈?zhǔn)歉拾彼崤c絲氨。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2590451