【摘要】：背景ENU化學(xué)誘變是正向遺傳學(xué)中最經(jīng)典高效的方式,是識(shí)別新基因并用以解析哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)分子基礎(chǔ)的強(qiáng)有力工具。T細(xì)胞作為機(jī)體適應(yīng)性免疫的主要細(xì)胞群,承擔(dān)著輔助機(jī)體抵抗病原體入侵、防御感染的重要作用。CD4蛋白是T細(xì)胞活化的共受體,結(jié)構(gòu)性研究已說明T細(xì)胞表面存在著CD4的四個(gè)胞外域,其中就包括與MHCII配體相連的第一個(gè)胞外域。但是關(guān)于活體模型中CD4胞外域與MHCII的聯(lián)系發(fā)生機(jī)制,目前尚沒有明確的研究和報(bào)道。目的利用ENU誘變?cè)诔Ｓ媒幌敌∈驝57BL/6J品系中建立免疫缺陷小鼠模型,探究得到的CD4輔助T淋巴細(xì)胞完全缺失表型的分子機(jī)制,在活體中研究CD4第一個(gè)胞外域的關(guān)鍵作用,以期建立研究CD4 T細(xì)胞的最佳小鼠模型。方法1.以近交系小鼠的典型代表C57BL/6J品系作為基因誘變的對(duì)象。選取8周齡的C57BL/6J雄鼠30只進(jìn)行腹腔ENU注射誘變,注射劑量為90mg/kg體重,按照每周一次的注射方式,連續(xù)注射三次。待經(jīng)過誘變處理的雄鼠度過不育期,長(zhǎng)至15周齡時(shí),與野生型C57BL/6J雌鼠1:1進(jìn)行合籠交配,作為G0構(gòu)建加系。待生產(chǎn)的同一窩G1在哺育期結(jié)束后進(jìn)行雌雄交配得到G2,再將同一窩生產(chǎn)的G2交配最終得到帶有純合突變的G3,即后續(xù)進(jìn)行表型分析的活體對(duì)象。2.利用眼內(nèi)眥靜脈采血法取G3代小鼠抗凝血約100μl,取30μl血樣與10μl抗體mix在流式管中混勻,冰上孵育30min;向其中加入400μl用蒸餾水與10xBD FACS裂解液稀釋成的1x裂解液,室溫避光孵育10min以裂解紅細(xì)胞;流式上樣分析。3.設(shè)計(jì)突變的Cd4基因序列,利用限制性內(nèi)切酶克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體PCI-Neo,得到瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒:pCI-mCD4。將與Cd4基因共表達(dá)的T2A-EGFP片段克隆到同樣的酶切位點(diǎn),得到最終的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCI-mCD4-EGFP。4.將質(zhì)粒及對(duì)照分別導(dǎo)入人HEK 293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后在熒光顯微鏡下查看轉(zhuǎn)染情況,并進(jìn)行流式熒光檢測(cè)。5.取CD3e敲除(CD3-/-)的小鼠作為受體對(duì)照,用磁珠試劑盒將Ly5.1Foxp3-eGFP供體小鼠脾臟和淋巴結(jié)中的CD4 T細(xì)胞純化出來,分別球后注射入對(duì)照和突變小鼠。過繼轉(zhuǎn)移6周后,取受體鼠血樣和脾臟淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行流式分析,檢測(cè)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)T細(xì)胞的比例和變化情況。結(jié)果1.得到CD4 T細(xì)胞缺失的突變家系:在G3代小鼠血液樣品中,CD4 T細(xì)胞完全缺失,而其它淋巴細(xì)胞的比例分布正常。將有表型突變小鼠與野生小鼠雜交得到CD4 T細(xì)胞比例正常的子代,且G3子代符合孟德爾遺傳定律,此突變?yōu)槌Ｈ旧w的性遺傳。2.通過外顯子捕獲和下一代基因測(cè)序技術(shù),確認(rèn)導(dǎo)致CD4 T細(xì)胞完全缺失是位于6號(hào)染色體上的Cd4基因124873055位T→A的點(diǎn)突變,導(dǎo)致編碼區(qū)第99位氨基酸發(fā)生由異亮氨酸到天冬酰胺的錯(cuò)義突變。3.此CD4缺失突變模型使Cd4完全喪失了在T細(xì)胞發(fā)育中的作用,造成CD4 T淋巴細(xì)胞完全缺失。4.CD4第99位氨基酸由異亮氨酸到天冬酰胺的突變不影響CD4蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)。5.C57BL/6J背景下,ENU誘變得到CD4T細(xì)胞缺失的小鼠可作為包括過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)在內(nèi)研究CD4 T細(xì)胞的理想模式動(dòng)物。結(jié)論ENU誘變導(dǎo)致C57BL/6J品系小鼠6號(hào)染色體Cd4基因124873055位堿基發(fā)生T→A的點(diǎn)突變,致使CD4第99位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘於０?得到CD4輔助T細(xì)胞完全缺失的小鼠模型,此突變小鼠可作為過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究CD4 T細(xì)胞的最佳模型。
【圖文】：

圖 1 ENU 誘變家系構(gòu)建示意圖型分析、留取鼠尾：對(duì) 8 周齡的 G3 代小鼠打耳標(biāo)標(biāo)記，從眼.5ml 抗凝靜脈管中，上下顛倒混勻，標(biāo)記耳標(biāo)號(hào)。同時(shí) 1.5ml EP 管中，標(biāo)記后置-20℃短暫保存以備提取 DNA箱；：將要標(biāo)記的抗體按照稀釋倍數(shù)混合為 mix，每個(gè)流式血樣輕微離心至管底，渦旋震蕩混勻，即刻取 30μl 樣品冰上避光孵育 30min；理：將 FACS lysing solution 與蒸餾水按照 1:9 的比例配樣品中加入 400μl，渦旋震蕩，室溫避光裂解 10min；：將處理好的樣品渦旋振蕩，用 BD FACS Canto 上樣因定位

圖 2 轉(zhuǎn)染試劑示意圖表 3 轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒配比XA MIXB2 3 1 125μl 0 Opti-MEM: 125μl 15μl 0 DNA(2500ng): 2.9μl 2P300: 5μl mixB 加入到 mixA 中，室溫靜置孵育 15-20min入到對(duì)應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)孔中；養(yǎng)基，加入新鮮 DMEM 培養(yǎng)基各 1.8ml；熒光顯微鏡查看轉(zhuǎn)染情況并流式分析。集到 1.5ml 離心管中，，標(biāo)記；min，吸棄上清；
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 韓曉楓,馬寶驪,張繼英,王利,柏峻;膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠淋巴細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移[J];免疫學(xué)雜志;2002年01期

2 丁蘭，朱振齊，羅貴民，孫啟安，楊同書，沈家驄;化學(xué)誘變抗體模擬谷胱甘肽過氧化物酶[J];生物化學(xué)雜志;1994年03期

3 張程亮;向明;鄒曉蕾;彭佳蓓;;髓源性樹突狀細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠免疫耐受及其機(jī)制[J];世界華人消化雜志;2006年33期

4 段連寧,李樹濃;T淋巴細(xì)胞表達(dá)殺傷細(xì)胞抑制性受體的研究進(jìn)展[J];中國(guó)病理生理雜志;2002年08期

5 張華昌;范小平;向?qū)W熔;楊明聰;;復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者的T淋巴細(xì)胞免疫因素的研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年10期

6 季陽,黃如欣,秦占芬,曹鳳,賈桂芳,馬京香,何智,金振良,倪平安,張建華;中國(guó)6省區(qū)獻(xiàn)血者人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ、Ⅱ型抗體血清流行病學(xué)調(diào)查[J];中華傳染病雜志;2000年04期

7 趙明峰,邵宗鴻;T淋巴細(xì)胞與陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥發(fā)病關(guān)系的研究現(xiàn)狀[J];中華血液學(xué)雜志;2002年11期

8 任自力 ,周平 ,朱曉玲;慢性阻塞性肺疾病虛實(shí)證型與T淋巴細(xì)胞關(guān)系探討[J];浙江中醫(yī)雜志;2002年06期

9 段連寧,李江琪,杜江,潘興華,郭坤元;優(yōu)勢(shì)化Ⅱ型T淋巴細(xì)胞表達(dá)殺傷細(xì)胞抑制性受體的初步觀察[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2004年01期

10 徐洪軍,徐永根,嚴(yán)向明,朱錦祥;體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)對(duì)小兒T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2004年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 朱平;;異基因造血干細(xì)胞移植后優(yōu)勢(shì)增殖T淋巴細(xì)胞的分析[A];第一屆全國(guó)難治性淋巴瘤學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第二屆全國(guó)多發(fā)性骨髓瘤學(xué)術(shù)研討會(huì)（國(guó)家級(jí)血液系統(tǒng)惡性腫瘤繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)習(xí)班）繼續(xù)教育集[C];2007年

2 ;異基因造血干細(xì)胞移植后優(yōu)勢(shì)增殖T淋巴細(xì)胞的分析[A];第11次中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文匯編[C];2007年

3 陸曉茜;劉霆;孟文彤;朱煥玲;席亞明;劉詠梅;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

4 胡曉梅;許勇鋼;全日城;楊曉紅;王洪志;徐述;郭小青;劉池;鄭春梅;張姍姍;肖海燕;唐旭東;李柳;劉鋒;麻柔;;骨髓增生異常綜合征T淋巴細(xì)胞異常與克隆造血[A];全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

5 陳燦;徐慶國(guó);李海林;彭波;伍旭東;;化學(xué)誘變對(duì)水稻生理特性的影響[A];中國(guó)作物學(xué)會(huì)2007年全國(guó)作物遺傳育種學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

6 葉均安;施明華;陳能品;郭勇;;中草藥飼料添加劑對(duì)肉雞T淋巴細(xì)胞免疫效應(yīng)的影響[A];第三屆全國(guó)飼料營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];1998年

7 陳燦;黃璜;徐慶國(guó);郭偉;李海林;彭波;;化學(xué)誘變對(duì)水稻葉綠素相對(duì)含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第十屆全國(guó)激光生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

8 張朝霞;王天有;;兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜T淋巴細(xì)胞功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十四次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

9 梁秋麗;施煥中;鄧靜敏;覃雪軍;梁象東;;吸入性變應(yīng)原和口服糖皮質(zhì)激素對(duì)過敏性支氣管哮喘患者血清可溶性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)粒原的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)哮喘學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)哮喘聯(lián)盟第一次大會(huì)論文匯編[C];2006年

10 裘影影;李晶;殷玉俊;湯郁;尤海燕;;骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合來氟米特對(duì)異基因小鼠T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[A];第十二屆全國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 包宇實(shí);前列腺素E_2對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用以及對(duì)異基因造血干細(xì)胞移植小鼠急性移植物抗宿主病的影響[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

2 郭春輝;失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[D];蘇州大學(xué);2015年

3 于鐵成;關(guān)于低能沖擊波對(duì)T淋巴細(xì)胞的作用及其作用機(jī)理的探討[D];吉林大學(xué);2004年

4 陳一鳴;T淋巴細(xì)胞識(shí)別自體慢性髓系白血病細(xì)胞腫瘤抗原的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1996年

5 王真;晚期糖基化終產(chǎn)物促星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老機(jī)理及衰老小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的凋亡抗性[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王慧杰;ENU化學(xué)誘變遺傳模型構(gòu)建與T淋巴細(xì)胞發(fā)育研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2017年

2 智蘊(yùn)濤;過繼轉(zhuǎn)移EAU的光學(xué)相干斷層掃描表現(xiàn)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

3 馬小亮;過繼轉(zhuǎn)移日本血吸蟲感染鼠DC亞群對(duì)OVA誘導(dǎo)的哮喘鼠肺臟炎癥抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

4 王松;微擬球藻化學(xué)誘變及富油藻株的高通量篩選研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

5 祁偉;紅掌離體化學(xué)誘變技術(shù)的研究[D];蘇州大學(xué);2016年

6 申妍姣;過繼轉(zhuǎn)移日本血吸蟲感染鼠樹突狀細(xì)胞亞群對(duì)哮喘抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

7 黎秋菊;異煙肼對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能影響的研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

8 易丹;慢性乙型肝炎患者HBV不同基因型肝組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞表達(dá)的研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2015年

9 劉偉;顱內(nèi)T淋巴細(xì)胞在腦出血后的變化規(guī)律及姜黃素的干預(yù)作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

10 陳苓苓;探討過繼轉(zhuǎn)移日本血吸蟲感染鼠樹突狀細(xì)胞通過對(duì)白介素-13的調(diào)控而抑制過敏性哮喘黏液分泌的作用機(jī)制[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2574227