【摘要】：鮑曼不動桿菌（A. baumannii）是一種革蘭陰性的機會致病菌，能夠?qū)е露喾N感染性疾病，感染尤其易出現(xiàn)在免疫缺陷、昏迷、術(shù)后、創(chuàng)傷后及一些慢性疾病的住院患者中。鮑曼不動桿菌感染所致死亡率在19-54%之間，其耐藥株的流行及其在環(huán)境中生存能力強等原因，都使其越來越引起人們的重視。鮑曼不動桿菌此前一直被認為是胞外菌，但近年來多項研究表明，鮑曼不動桿菌能夠粘附、侵入多種哺乳動物細胞，并能夠在宿主細胞中生存。但宿主免疫與鮑曼不動桿菌感染的關(guān)系和機仍不明確。 自噬是一種細胞程序化死亡過程，也是真核生物進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程，對于細胞在饑餓狀態(tài)下得以存活，自噬起到非常重要的作用，它能夠清除一些多余的或老化的細胞器，以此維持代謝的平衡和某些細胞器的更新。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，形成自噬小體，自噬小體通過與溶酶體融合，最終在自噬溶酶體中降解。 自噬已被發(fā)現(xiàn)與機體控制多種細胞內(nèi)微生物感染有關(guān)，鮑曼不動桿菌是否會介導(dǎo)自噬的發(fā)生，自噬對鮑曼不動桿菌的感染有何作用，尚無文獻報道。本課題組對鮑曼不動桿菌在哺乳細胞中是否能誘導(dǎo)自噬反應(yīng)進行了探索。 本研究旨在明確鮑曼不動桿菌是否能誘導(dǎo)哺乳細胞發(fā)生自噬，并在此基礎(chǔ)上研究其發(fā)生的起始過程（哪些配體蛋白參與）、信號通路及該自噬反應(yīng)對感染結(jié)局的影響，并探討在此反應(yīng)中鮑曼不動桿菌的關(guān)鍵因子。 本研究采用LC3熒光表達蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞后感染鮑曼不動桿菌，應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑預(yù)處理及用自噬抑制劑預(yù)處理后感染鮑曼不動桿菌，在共聚焦顯微鏡下觀察LC3熒光斑點形成情況；應(yīng)用透射電鏡觀察鮑曼不動桿菌感染的HeLa細胞的自噬小體等結(jié)構(gòu)，以證實自噬的發(fā)生；應(yīng)用蛋白印跡法檢測感染鮑曼不動桿菌的細胞的LC3表達情況，通過計算LC3-II/LC3-I比值來評判細胞自噬程度；通過免疫熒光染色法，研究胞內(nèi)鮑曼不動桿菌菌體與致敏蛋白的共定位關(guān)系，以判斷哪些蛋白參與了自噬的起始過程，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，敲除其中的某些蛋白后的細胞感染鮑曼不動桿菌，通過免疫熒光染色及Western方法，判斷細菌與其他致敏蛋白共定位情況及LC3表達情況來明確某些蛋白在菌體致敏自噬過程中的作用；通過免疫熒光染色技術(shù)及蛋白印跡技術(shù)，檢測胞內(nèi)菌體與LC3斑點、酸化溶酶體及LAMP1的共定位關(guān)系及p62在感染細胞中的表達情況，明確該自噬是否為完全自噬；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)及信號通路特異性抑制劑，通過共聚焦顯微鏡觀察及蛋白印跡技術(shù)檢測LC3表達情況，研究該自噬的信號通路；應(yīng)用鮑曼不動桿菌野毒株及其磷脂酶D突變株感染HeLa細胞，通過蛋白印跡技術(shù)檢測LC3表達情況，研究磷脂酶D對該自噬的影響，并進而通過磷脂酶D原核表達及免疫熒光技術(shù)，研究磷脂酶D對該自噬的影響的作用位點；最后，通過瓊脂糖平板細菌涂板及共聚焦顯微鏡觀察，鮑曼不動桿菌感染巨噬細胞，明確自噬對鮑曼不動桿菌細菌清除的影響。 結(jié)果如下： （1）我們用鮑曼不動桿菌感染HeLa細胞，通過共聚焦顯微鏡觀察及蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌可以誘導(dǎo)HeLa細胞發(fā)生自噬反應(yīng)，并通過透射電鏡觀察證實了感染鮑曼不動桿菌的HeLa細胞內(nèi)自噬小體的形成。本研究也通過免疫熒光染色、蛋白印跡等方法，證實了該自噬為完全性自噬。 （2）鮑曼不動桿菌誘導(dǎo)的自噬是通過泛素E3連接酶LRSAM1與泛素化蛋白包繞菌體，并與募集的自噬的配體蛋白NDP52及p62/SQSTM1作用而啟動的。敲除骨架蛋白sept2和sept9后，，感染鮑曼不動桿菌的細胞的p62/SQSTM1和NDP52不能在菌體周圍募集，鮑曼不動桿菌誘導(dǎo)的自噬受到抑制，從而說明鮑曼不動桿菌誘導(dǎo)的自噬依賴于骨架蛋白成分。通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)、特異性蛋白抑制劑，發(fā)現(xiàn)Beclin-1/Atg7/Atg8、MEK/ERK及AMPK-mTOR-ULK1信號通路參與了鮑曼不動桿菌誘導(dǎo)哺乳細胞的自噬反應(yīng)的發(fā)生。 （3）最后，我們通過瓊脂糖涂板及光學(xué)觀察方法，應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑及抑制劑，證實了自噬能夠促進宿主細胞對胞內(nèi)鮑曼不動桿菌的清除。 綜上所述，本實驗首次發(fā)現(xiàn)并證實了鮑曼不動桿菌能夠誘導(dǎo)哺乳動物細胞發(fā)生自噬反應(yīng)，也明確了自噬對鮑曼不動桿菌感染的作用，為鮑曼不動桿菌感染的治療提供了新思路。 本研究的創(chuàng)新點在于國內(nèi)外率先開展對鮑曼不動桿菌引起自噬現(xiàn)象及自噬對鮑曼不動桿菌感染的影響進行系統(tǒng)研究，并對其發(fā)生機制、信號途徑及鮑曼不動桿菌參與自噬的蛋白分子進行深入探索。
【圖文】：

第 1 章 文獻綜述適應(yīng)環(huán)境壓力，并能做出改變的能力。鮑曼不動桿菌對天然耐藥機制的不為一個多重耐藥的病原體。鮑曼不動桿菌具有強大的獲得耐藥性和克隆傳重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動桿菌呈世界性流行，已成為我國院內(nèi)病原菌之一。曼不動桿菌在抗生素壓力下，比如在一個高危環(huán)境下（在醫(yī)院監(jiān)護病房中被廣泛使用），有捕獲抗性基因的能力，基因多態(tài)性分析也印證了，鮑曼分的耐藥基因都是新近從綠膿桿菌、沙門菌屬或大腸桿菌獲得的（Fou。還有一些耐藥基因來源于遺傳，也有一些遺傳基因來源于偶然的突變。（動桿菌耐藥性的出現(xiàn)可能是病人間相互傳播的征象，也可以當成是鮑曼不發(fā)的一個預(yù)兆（Villegas，2003）。

圖 1.2 大自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬的模式圖Figure1.2 Model cart of macroautophagy, microautophagy and chaperone-mediatedautophagy1.3.2.2.1 大自噬對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的研究揭示了細胞生物學(xué)中控制蛋白質(zhì)降解的不同的關(guān)鍵方面。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)主要局限于針對哪些被破壞的蛋白，但細胞也需要處理更的受損的、可能有毒性的或多余的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中也包括完整的細胞器，而這都是噬能涉及的功能范圍（Yang，2010）。細胞質(zhì)里的某些胞質(zhì)內(nèi)容物或一些細胞器被隔進一個雙層膜結(jié)構(gòu)中，這個雙層膜結(jié)構(gòu)通過延伸和閉合，形成一個封閉的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，被稱為自噬小體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體。最后在自噬溶酶體中來自溶酶體的各種水解酶把這些內(nèi)容物降解、重新釋放回胞質(zhì)內(nèi)循環(huán)再利用。這個過稱為大自噬，即我們通常所說的自噬。（圖 1.2）大自噬是介導(dǎo)細胞成分降解的主要
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378

【共引文獻】

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2 陳佰義;何禮賢;胡必杰;倪語星;邱海波;石巖;施毅;王輝;王明貴;楊毅;張菁;俞云松;;中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2012年08期

3 柯丹霞;印遇龍;;小G蛋白對mTOR信號通路的調(diào)控[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年08期

4 侯麗穎;孫燕佩;張旭光;趙棟;吳坤;;維生素E琥珀酸酯通過Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)人胃癌細胞SGC-7901發(fā)生保護性自噬[J];癌變.畸變.突變;2013年05期

5 程玉;李春輝;;胃癌中Cx43與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)性的研究進展[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年05期

6 陳松峰;邵增務(wù);;自噬相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進展[J];國際骨科學(xué)雜志;2013年04期

7 鄭溜豐;彭健;;中樞神經(jīng)系統(tǒng)整合外周信號調(diào)節(jié)采食量的分子機制[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年10期

8 周亮;張喜鳳;周娜汝;吳蓉花;李運生;張宇;張運海;;雷帕霉素對小鼠體外受精胚胎早期發(fā)育的影響[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2013年12期

9 肖堂利;孫蕾;管旭;楊可;何婷;徐新麗;黃云劍;趙景宏;;雷帕霉素對糖尿病腎病小鼠足細胞自噬的改善作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2013年23期

10 Jun Cheng;Min Quan;Liang Wu;Qi Wang;;The Role of Autophagy in Hepatitis C Virus Infection[J];Infection International(Electronic Edition);2012年01期

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1 孟韜;馬蘭萍;于霆;王昕;余科;沈競康;;mTOR激酶抑制劑SCC-31的臨床前研究[A];第十二屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會論文集[C];2014年

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本文編號：2573788