【摘要】：傳染病的暴發(fā)(outbreak)和流行(pandemic)嚴重威脅著人類的健康和生存。在全球化(globalization)和工業(yè)化(industralization)背景下,疾病的傳播和流行異常迅速。而新病原出現(xiàn)的速度也似乎超過了過去的任何時期。野生動物在人獸共患病(zoonosis)的發(fā)生、傳播和流行中發(fā)揮重要作用。對野生動物所攜帶病原進行檢測、分離與鑒定以及論證其與疾病的相關(guān)性,成為當前傳染病研究的一個新的熱點。隨著技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)代分子生物學方法在病原的發(fā)現(xiàn)和鑒定中發(fā)揮越來越重要的作用。以宏基因組學(metagenomics)和新一代測序技術(shù)(next-generation seqeuncing, NGS)等為代表的分子生物學方法能夠從樣本中直接分析DNA或RNA遺傳物質(zhì),在病原鑒定中非常適用。2002年和2012年分別暴發(fā)的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV),促使廣大研究者密切關(guān)注冠狀病毒的生物多樣性、基因組學和跨物種傳播的可能性,尤其是來源于蝙蝠(第二大哺乳動物群體)的冠狀病毒。目前已知蝙蝠攜帶有多種多樣的病原體,因此在新發(fā)人畜共患病和跨物種傳播疾病的監(jiān)測中,蝙蝠是優(yōu)先關(guān)注的對象。本研究通過泛冠狀病毒RT-PCR篩選(pan-coronaviral screening)和新一代測序技術(shù),從棕果蝠(Rousettus leschenaulti)的直腸拭子樣本中鑒定出一種新型蝙蝠冠狀病毒,將其命名為果蝠冠狀病毒GCCDC1 (Rousettus bat coronavirus GCCDC1,Ro-BatCoV GCCDC1)。Ro-BatCoV GCCDC1 在基因組結(jié)構(gòu)和組成上與果蝠冠狀病毒HKU9 (Ro-BatCoV HKU9)類似,但是序列和進化分析表明Ro-BatCoV GCCDC1是一種新型蝙蝠冠狀病毒。更為引人注意的是,在病毒基因組的3'末端整合有一個獨特的基因——p10基因,這個基因在所有已知的冠狀病毒中都找不到同源序列,序列和進化分析表明可能來源于一個古老的蝙蝠正呼腸孤病毒。亞基因組mRNA和細胞水平試驗表明Ro-BatCoV GCCDC1的p10基因與正呼腸孤病毒的p10基因一樣是一個功能基因。在病毒復制周期中,p10基因可能能夠促進病毒在細胞與細胞之間轉(zhuǎn)移。這株病毒的發(fā)現(xiàn)是單股正鏈RNA病毒與雙股分節(jié)段的RNA病毒之間跨科重組的第一次報道。對該冠狀病毒的進一步研究能夠深入了解病毒間異源重組的機制。蝙蝠冠狀病毒HKU9 (Ro-BatCoV HKU9)是一種重要的Beta冠狀病毒,系統(tǒng)進化上與MERS-CoV隸屬于同一個屬。對蝙蝠進行監(jiān)測的數(shù)據(jù)表明BatCoV HKU9在蝙蝠群體中廣泛流行,因此有必要對這個病毒跨越種間屏障的潛在可能性進行研究。冠狀病毒spike蛋白中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Receptor binding domain,RBD)識別宿主受體以介導病毒侵入,因此是決定病毒趨向性和傳播能力的關(guān)鍵因子。本研究中,通過一系列生物物理和晶體學方法對BatCoV HKU9假定的Spike蛋白RBD進行了研究。表面等離子體共振結(jié)果表明HKU9-RBD既不結(jié)合SARS-CoV 的受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2),也不結(jié)合MERS-CoV的受體CD26。我們進一步解析了 HKU9-RBD的分子結(jié)構(gòu),分析顯示該分子結(jié)構(gòu)由一個核心和一個外部亞結(jié)構(gòu)域組成。核心亞結(jié)構(gòu)域的折疊形式與其他Beta冠狀病毒RBD的相似,而外部亞結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上具有獨特的特點,僅由一個單一的螺旋組成,這一結(jié)構(gòu)解釋了 HKU9-RBD不與ACE2和CD26結(jié)合的原因。通過比較目前已知的所有Beta冠狀病毒RBD結(jié)構(gòu),我們進一步提出同源的亞結(jié)構(gòu)域插入結(jié)合模式,核心亞結(jié)構(gòu)域和外部亞結(jié)構(gòu)域通過這一模式錨定在一起。通過對HKU9-RBD的結(jié)構(gòu)解析及其與其他Beta冠狀病毒的RBD比較,對于闡明Beta冠狀病毒受體結(jié)合特性及進化規(guī)律具有重要參考價值,對于評價HKU9病毒的跨種傳播潛力具有重要提示作用。
【圖文】：

蝠冠狀病毒Ｒｏ－ＢａｔＣｏＶ邋ＨＫＵ９相似。主要開放閱讀框（０ＲＦ）的數(shù)量和順序上逡逑均為：５’－邋ｒｅｐｌｉｃａｓｅ邋ＯＲＦｌａｂ邋－邋ｓｐｉｋｅ邋－邋ＮＳ３邋－邋ｅｎｖｅ丨ｏｐｅ邋（Ｅ）邋－邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋（Ｍ）－逡逑ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－（Ｎ）－３’，緊接著是編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的輔助基因（圖１．１）。逡逑ＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴｎＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＧＴＡＣＧＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＡＣ逡逑？邋？？？邋Ｌｅａｄｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邐邐邐逡逑？？邋５ｖｉｌＴＲ邋＾￣ＯＲＦｌａ邐■邋１■曑＾＾ＮＳ７ｂ［＾ｆ邋３？ＵＴＲ邋－ｐ0ｌ＞邋Ａ逡逑．？＊ＰＬ２ｐｒｏ邐？？邐Ｓ邋＾逡逑？？邋個邐Ｈｃｌｉｃａｓｅ邋ＮｃｎｄｏＵ邋＼邐？邋＊逡逑１Ｍ［３－呷邋Ａ｜７｜８ｈ｜ｌｔｆｒｒ＾Ｕ逡逑ａｄｒｐ邋３ＣＬｐｒ0邐Ｊ邋Ｊ邋｜邐．；■邐ｓｅｇｍｅｎｔ邋ＳＩ逡逑ＲｄＲｐ邋ＥｘｏＮ邋Ｏ－ＭＴ逡逑趣？S茫篰~邋ｉｆ逡逑Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ邋ｌｅｓｃｈｅｎａｕｌｔｉ邐Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ邐Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ逡逑圖１．１蝙蝠冠狀病毒Ｒｏ－ＢａｔＣｏＶＧＣＣＤＣ１基因組組成。非結(jié)構(gòu)基因和推測的成熟結(jié)構(gòu)蛋白、逡逑結(jié)構(gòu)基因、５’－和３’－ＵＴＲ分別以黃色、深藍色和淺藍色標示。特征性ｐｌＯ基因以紅色表示。逡逑ｐｌＯ基因的潛在來源以虛箭頭和問號標示。先導序列（ｌｅａｄｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ）和先導轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序逡逑列（ＴＲＳ邋）直接以核苷酸表示。編幅（

這些測得的序列與ＮＧＳ數(shù)據(jù)及之前確認試驗中ｓａｎｇｅｒ測序的結(jié)果一致。逡逑如測序峰圖中顯示，，測得的序列連續(xù)地從Ｎ基因延伸、基因間隔序列、整個ｐｌＯ逡逑基因、然后跨過基因間隔序列和ＴＲＳ，最后進入ＮＳ７ａ基因（圖１．５邋ａ）。同時，逡逑如果圖１．５邋ｂ中顯示的，ｐｌＯ的ＴＲＳ位于Ｎ基因的編碼序列中，核心序列為５’－逡逑ＡＣＡＡＡＣ邋－３’，其中一個堿基與很多冠狀病毒的ＴＲＳ共有核心序列存在一個核苷逡逑酸的差異。ｐｌ0基因的ＴＲＳ與起始密碼子之間的間隔序列為９７個氨基酸，比先逡逑導ＴＲＳ和ＯＲＦｌａｂ之間的間隔序列短，但是比其他所有基因之前的間隔序列要逡逑長。序列分析進一步表明Ｎ基因下游基因的ＴＲＳ所在的位置存在一定的差異（圖逡逑１．６）0逡逑＋邐．．．邋．廠－邐ｐｌ0邐＋逡逑—．ａＡ－邐＾逡逑＾邐」？？？（々）？？？邋邐逡逑＾邐ｐｉｏ邐＾邐Ｉ邋ＮＳ７ａ邋■逡逑Ｉ．．邋．邋Ｉ邐ｉ邋Ｊ邐－逡逑ｉ１邋－ｉｖ邐十邋｜邋ｐｉ0邋ｊ逡逑ｂ邐Ａａａａ／＾＾Ｂ
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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2 丁珍;冠狀病毒N蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的分子機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2017年

3 申梁;基于人冠狀病毒OC43重組病毒抗病毒高通量篩選平臺的建立及初步應(yīng)用[D];中國疾病預防控制中心;2017年

本文編號：2558582