發(fā)布時間：2019-11-03 11:32

【摘要】：目的利用裝甲RNA技術制備一種能夠應用于戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)核酸檢測的陽性質(zhì)控品,為臨床上HEV核酸分子水平檢測提供可靠的質(zhì)控工具,為相關HEV的診斷試劑盒研發(fā)奠定理論與技術基礎。方法設計將MS2噬菌體基因組的5’端部分非編碼區(qū)、成熟酶蛋白、衣殼蛋白以及部分復制酶起始位點等編碼基因與HEV ORF2/ORF3保守區(qū)部分基因序列串聯(lián)并合成目標基因MS2-HEV。并將MS2-HEV基因克隆、插入原核表達載體p ET-28b中構(gòu)建p ET-28b-MS2/HEV重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)4小時后,SDS-PAGE鑒定表達情況;將驗證的表達菌體首先經(jīng)過超聲破碎、離心、取上清、去除核酸雜質(zhì)后再經(jīng)超濾離心純化、濃縮,電鏡分析鑒定假病毒形態(tài);穩(wěn)定性檢測包括DNase I、RNase A抗性試驗以及在血液中保存期檢驗三個方面,最終確定假病毒穩(wěn)定性參數(shù)。結(jié)果1、PCR鑒定及測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒p ET-28b-MS2/HEV成功構(gòu)建,SDS-PAGE電泳檢測到14k Da的位置出現(xiàn)目的條帶表明重組MS2-HEV基因獲得有效表達,超濾離心純化后的重組假病毒顆粒僅有一條目的帶無雜帶表明假病毒得到高純度純化濃縮。2、電鏡鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)直徑約27nm二十面體對稱的假病毒顆粒,說明假病毒組裝成功。RT-PCR鑒定得到349bp大小的目的條帶,這些結(jié)果表明設計的HEV保守基因序列成功地被包裝到重組HEV假病毒顆粒中。3、病毒顆粒穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明制備的HEV假病毒能夠有效抵抗高濃度的DNase I和RNase A的降解作用,并且放置在血液中的假病毒顆粒,-20℃條件下可以持續(xù)保存六個月而無明顯降解。結(jié)論本研究成功的制備出HEV假病毒顆粒,并且該HEV假病毒顆粒具有很強的穩(wěn)定性及仿真性,達到了作為RNA病毒核酸檢測陽性質(zhì)控品的基本要求。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373.21

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本文編號：2555058