【摘要】：目的:制備單體C-反應(yīng)蛋白(monomeric C-reactive protein,mCRP)的單克隆抗體。方法:用合成的人C-反應(yīng)蛋白末端八肽氨基酸,與牛血清白蛋白偶聯(lián)后免疫BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5∶1的比例融合,間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和有限稀釋法進(jìn)行單克隆雜交瘤細(xì)胞的篩選;制備腹水抗體;采用Protein G親和層析法純化抗體,用間接ELISA和Western blot方法測(cè)定抗體特異性,并采用該單抗研究其對(duì)mCRP干預(yù)的乳大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果:得到1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,純化后的單克隆抗體純度達(dá)98%,抗體活性良好,并且該抗體可以降低mCRP導(dǎo)致的心肌細(xì)胞TGF-β的表達(dá)。結(jié)論:成功獲得1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,并對(duì)其初步應(yīng)用進(jìn)行了鑒定,并證實(shí)其可以中和mCRP引起的心肌細(xì)胞的損傷作用。
【圖文】：

ne-wayANOVA）比較各組間均數(shù)差異，P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1雜交瘤細(xì)胞株的建立細(xì)胞融合后經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選以及間接ELISA檢測(cè)，取上清效價(jià)最高的細(xì)胞株采用有限稀釋法單克隆化3次。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)14周后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且經(jīng)液氮凍存、復(fù)蘇后，此細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌特異性抗mCRP抗體。2．2單抗的純化小鼠腹腔接種分泌mCRP單抗的雜交瘤細(xì)胞后共獲得15ml腹水，采用ProteinG親和層析法提取純度較純、活性較好的mCRP抗體，進(jìn)行SDS-PAGE（圖1）。2．3單抗的鑒定抗體的效價(jià)測(cè)定結(jié)果見圖2，表明所制備的mCRP抗體與mCRP蛋白有較好的親和力。Westernblot結(jié)果顯示所純化的mCRP抗體能與mCRP蛋白特異性結(jié)合，在23000處出現(xiàn)目的條帶，與mCRP蛋白的預(yù)期大小相符（圖3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀釋倍數(shù)純化的mCRP抗體SP2／0培養(yǎng)上清圖2抗mCRP抗體效價(jià)的檢測(cè)Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2為純化后的mCRP抗體（樣品經(jīng)過還原，上樣量為30μg／孔）。圖1SDS-PAGE檢測(cè)純化的mCRP抗體Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·

ne-wayANOVA）比較各組間均數(shù)差異，P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1雜交瘤細(xì)胞株的建立細(xì)胞融合后經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選以及間接ELISA檢測(cè)，取上清效價(jià)最高的細(xì)胞株采用有限稀釋法單克隆化3次。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)14周后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且經(jīng)液氮凍存、復(fù)蘇后，此細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌特異性抗mCRP抗體。2．2單抗的純化小鼠腹腔接種分泌mCRP單抗的雜交瘤細(xì)胞后共獲得15ml腹水，采用ProteinG親和層析法提取純度較純、活性較好的mCRP抗體，，進(jìn)行SDS-PAGE（圖1）。2．3單抗的鑒定抗體的效價(jià)測(cè)定結(jié)果見圖2，表明所制備的mCRP抗體與mCRP蛋白有較好的親和力。Westernblot結(jié)果顯示所純化的mCRP抗體能與mCRP蛋白特異性結(jié)合，在23000處出現(xiàn)目的條帶，與mCRP蛋白的預(yù)期大小相符（圖3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀釋倍數(shù)純化的mCRP抗體SP2／0培養(yǎng)上清圖2抗mCRP抗體效價(jià)的檢測(cè)Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2為純化后的mCRP抗體（樣品經(jīng)過還原，上樣量為30μg／孔）。圖1SDS-PAGE檢測(cè)純化的mCRP抗體Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管科;江蘇省盛澤醫(yī)院心血管科;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(30900602) 江蘇省科技廳自然科學(xué)基金(BK2011382) 江蘇省“六大人才高峰”(2011WSN-029)
【分類號(hào)】：R392-33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉劍南;陳相健;戴健;馬繼政;楊笛;張寄南;;C-反應(yīng)蛋白對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的影響[J];中國(guó)臨床康復(fù);2006年21期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 古江勇;袁谷;朱永宏;徐筱杰;;芪參益氣滴丸治療心血管疾病的計(jì)算藥理學(xué)研究[J];中國(guó)科學(xué)(B輯:化學(xué));2009年11期

2 劉強(qiáng);張丹丹;徐晉Y

本文編號(hào)：2541132