【摘要】：由于甲型流感病毒變異快、抗甲流病毒的化學(xué)藥物毒副作用大,易產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)有效疫苗的制備難度很大,因此尋找一種安全、簡(jiǎn)便、高效的甲型流感防治藥物成為目前具有挑戰(zhàn)性的研究課題。卵黃抗體(Egg yolk immunoglobulin, IgY)具有來源廣、特異性好、安全無殘留、性能穩(wěn)定及價(jià)格合理等優(yōu)點(diǎn),在病毒性疾病的預(yù)防、治療和診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題采用滅活甲型流感病毒為抗原免疫產(chǎn)蛋雞,制備特異性IgY,對(duì)IgY的體內(nèi)外抗病毒活性及其在甲型流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行研究,為特異性IgY在甲型流感的預(yù)防、治療及檢測(cè)方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容分為四部分：1抗甲型流感病毒卵黃抗體的制備1.1以滅活甲型H1N1流感病毒A/廣東/732/2009(H1N1)pdm09和A/加利福尼亞州/7/2009(H1N1)pdm09毒株及季節(jié)性甲型流感病毒A/廣東/622/2009(H1 N1)和A/廣東/749/2009(H3N2)毒株為抗原分別免疫蛋雞獲得特異性IgY。采用PEG沉淀法得到IgY純度95.80%,回收率93.01%。1.2經(jīng)ELISA檢測(cè),不同抗原免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致,1 mg/mL的IgY的最高效價(jià)達(dá)3200,最高效價(jià)在卵黃中可持續(xù)6周,高效價(jià)抗體(2500)在卵黃中可持續(xù)10周以上。2抗甲型H1N1流感病毒卵黃抗體的體外活性評(píng)價(jià)主要對(duì)抗甲型H1N1流感病毒A／廣東/732/09(H1N1)pdm09 IgY的抗病毒活性進(jìn)行了分子水平和細(xì)胞水平上的評(píng)價(jià)。2.1瓊脂擴(kuò)散和熒光免疫實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明IgY能與病毒顆粒結(jié)合并使其產(chǎn)生沉淀；Western Blot分析和HI實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示IgY能與病毒表面的主要膜蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)及基質(zhì)蛋白(M)發(fā)生特異性結(jié)合,能有效抑制病毒對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用,1.0mg/mL的IgY能完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高稀釋倍數(shù)為128。2.2空斑減數(shù)試驗(yàn),結(jié)果說明IgY能有效中和病毒,直接抑制病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附,IC50 2.0 μg/mL;能有效阻止病毒吸附于細(xì)胞；能抑制細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制增殖；體外抗病毒作用明顯、穩(wěn)定。3抗甲型H1N1流感病毒卵黃抗體的小鼠體內(nèi)抗病毒活性研究3.1 IgY對(duì)A/廣東/732/2009(H1N1)pdm09感染小鼠的死亡保護(hù)作用將BALB/C小鼠隨機(jī)分為15組,正常組,模型組,磷酸奧司他韋治療組,抗A/廣東/732/09 (H1N1)pdm09 IgY預(yù)防組(含大、中、小劑量3組)、治療組(含大、中、小劑量3組)和預(yù)防-治療組(含大、中、小劑量3組),陰性IgY中劑量預(yù)防組、治療組和預(yù)防-治療組。以5LD50的流感病毒液每只50.0gL滴鼻感染小鼠造模,正常組以生理鹽水滴鼻對(duì)照。預(yù)防組在感染前2h給藥1次；治療組自感染后2h開始給藥,每天1次,持續(xù)給藥4天；預(yù)防-治療組感染前2h給藥1次,其他給藥同治療組。自造模當(dāng)日起連續(xù)觀察2周,計(jì)算各組存活率及體重保持率。結(jié)果顯示：①模型組和陰性IgY各組的存活率都為10%。特異性IgY各組存活率≥90%,與模型相比較有極顯著性差異,P0.001。②模型組和陰性IgY各組的小鼠體重均先下降,后緩慢上升,顯著低于正常組。特異性IgY各組體重明顯高于模型組。特異性IgY中劑量治療組的體重變化和存活率與磷酸奧司他韋治療組無差異。3.2 IgY對(duì)A／廣東/732/09 (H1N1)pdm09感染小鼠肺損傷及病毒增殖的影響將BALB/C小鼠隨機(jī)分為6組,正常組,模型組,磷酸奧司他韋治療組,抗A/廣東/732/09 (H1N1)pdm09 IgY中劑量預(yù)防組、治療組和預(yù)防-治療組。分別在感染后第3天和第6天隨機(jī)處死小鼠,摘取肺臟。計(jì)算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率,應(yīng)用RT-PCR測(cè)定感染小鼠肺組織病毒載量,HA實(shí)驗(yàn)測(cè)定感染小鼠肺組織病毒滴度,HE染色光鏡觀察感染小鼠肺部組織的病理學(xué)變化。結(jié)果顯示：①各個(gè)時(shí)間點(diǎn),模型組與IgY各組的肺指數(shù)均有上升趨勢(shì),但I(xiàn)gY各組肺指數(shù)明顯低于模型組。感染后第3天,IgY各組與模型組相比有顯著性差異,P0.05；感染后第6天,IgY各組與模型組相比較有極顯著性差異,P0.01。②各個(gè)時(shí)間點(diǎn),模型組小鼠肺組織病毒載量和病毒滴度都明顯高于IgY各組。IgY預(yù)防-治療組與模型組相比較,具有極顯著差異,P0.001；其他各組與模型組相比較,均具有極顯著性差異,P0.01。③在病理組織切片中,IgY各組的肺組織結(jié)構(gòu)基本完整,壞死與浸潤(rùn)級(jí)別低。4甲型H1N1流感病毒表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫分析方法的建立與應(yīng)用以檸檬酸三鈉為還原劑成功制備金溶膠；用4,4'-聯(lián)吡啶作為拉曼標(biāo)記分子對(duì)金溶膠進(jìn)行標(biāo)記制備標(biāo)記金溶膠；用IgY與標(biāo)記金溶膠結(jié)合制備標(biāo)記免疫金溶膠；標(biāo)記免疫金溶膠與標(biāo)記金溶膠的SERS圖譜相一致。采用硅烷化、醛基化的方法在凹形載玻片上進(jìn)行IgY的組裝,制備固相抗體。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟,建立表面增強(qiáng)拉曼光譜標(biāo)記免疫分析檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的方法,對(duì)甲型H1N1流感病毒進(jìn)行檢測(cè),病毒滴度在0.2 TCID50到2000 TCID50范圍內(nèi),4,4'-聯(lián)吡啶的SERS信號(hào)和抗原濃度呈線性關(guān)系,線性方程是Y=2348.4 X-1525.8,相關(guān)系數(shù)為0.9998。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 第一章緒論逡逑結(jié)構(gòu)，共Ｈ層，從外到內(nèi)一次為雙層囊膜、基質(zhì)蛋白和核殼體口，－２９１。Ａ型流感逡逑病毒顆粒的結(jié)構(gòu)和組成如圖１－１ＩＷ。逡逑在最外層的囊膜上分布著ＨＡ和ＮＡ兩種糖蛋白，ＨＡ、ＮＡ根植于宿主逡逑來源的脂質(zhì)雙層膜中，因突出在病毒的外表面而稱為刺突。蛋白Ｍ２稱為離逡逑子通道，貫穿病毒的雙層囊膜。逡逑：邋■邋！逡逑ＩＰＢ１逡逑？詩(shī)逡逑圖１－１甲型流感病毒顆粒的結(jié)構(gòu)和組成逡逑Ｆｉｇ．ｌ－ｌ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓ邋ｐ；＂邋ｔｋｌｅ逡逑（引自邋Ｍａｒｋ邋ｖｏｎ邋Ｉｔｚｓ化ｉｎ邋等專著：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ｖｉｉ邋ｕｓＳｉａｌＵｌａｓｅ邋－邋Ａ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ逡逑Ｔａｒｇｅｔ，邋２０１１）逡逑中間層為球形蛋白殼，由基質(zhì)蛋白Ｍｌ形成，位于脂質(zhì)雙層膜下面，與逡逑病毒囊膜內(nèi)壁緊密接合，，共同構(gòu)成流感病毒的外殼骨架，對(duì)保護(hù)病毒核屯、和逡逑維持病毒空間結(jié)構(gòu)起著重要作用。逡逑５逡逑
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 在ＨＡ的結(jié)構(gòu)研究中，研究最透徹的是胞外區(qū)的結(jié)構(gòu)。在１９８１、１９９４和逡逑１９９８ｆ＂－４＂年分別測(cè)定了融合前的構(gòu)象、榞合后的構(gòu)象和未切割前體所對(duì)應(yīng)的逡逑晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示如圖１－２所示［＂１，ＨＡ１亞單位用呁色表示，ＨＡ２亞單位逡逑用紅色表示，ＨＡ１的３２３位殘基到ＨＡ２的１２位殘基用綠色表示，病毒囊膜逡逑位于底部，球狀頭部位于頂部，ＨＡ１和ＨＡ２之間的切割位點(diǎn)存在與靠近一逡逑個(gè)深腔的環(huán)中。逡逑８逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392;O657.37

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8 主任醫(yī)師 冀衡;流感病毒[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2003年

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本文編號(hào)：2514138