【摘要】：第一章結(jié)核抗原持續(xù)刺激致T細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)研究結(jié)核病是一種慢性感染性疾病,由結(jié)核分枝桿菌感染引起,是全球危害最為嚴(yán)重的傳染病之一。有研究報(bào)道嚴(yán)重的結(jié)核病患者CD4+T細(xì)胞,尤其是Th1細(xì)胞數(shù)目下降。我們也發(fā)現(xiàn)痰菌陽性的纖維空洞型結(jié)核病患者對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原的T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力低于密切接觸者和結(jié)核病新發(fā)病人。以上現(xiàn)象都提示嚴(yán)重的結(jié)核分枝桿菌感染可能造成機(jī)體免疫功能低下,其發(fā)生機(jī)制值得深入研究。目的:通過結(jié)核抗原持續(xù)刺激建立T細(xì)胞耗竭小鼠模型,分析抗原持續(xù)刺激在結(jié)核病T細(xì)胞耗竭中的作用及可能的機(jī)制和治療措施。方法:1,本研究采用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)免疫C57BL/6小鼠,用結(jié)核亞單位蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(簡稱LT70)聯(lián)合Mtb10.4-Hsp X(簡稱MH)反復(fù)免疫10次,模擬結(jié)核分枝桿菌抗原持續(xù)刺激的狀態(tài),建立T細(xì)胞耗竭模型。2,通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析脾臟T細(xì)胞IFN-γ和IL-2的分泌水平;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)目;通過TB10.44-12五聚體標(biāo)記檢測(cè)TB10.4特異性的記憶性CD8+T細(xì)胞數(shù)目;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+/CD8+T細(xì)胞表面程序性死亡受體1(Programmed Death 1,PD-1)的表達(dá);通過BCG和銅綠假單胞菌攻擊,檢測(cè)不同模型組保護(hù)效果差異;進(jìn)一步檢測(cè)CD34-LinSca-1+c-Kit+造血干細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力。3,在T細(xì)胞耗竭模型基礎(chǔ)上,應(yīng)用造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、IL-2和雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療,檢測(cè)以下指標(biāo):抗原特異性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平;TB10.4特異性的記憶性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量;CD4+T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1的表達(dá);BCG攻擊后的保護(hù)效果;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力。通過上述指標(biāo)檢測(cè)評(píng)價(jià)不同治療方案的治療效果。4,在IL-2具有逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索IL-2與造血干細(xì)胞增殖分化相關(guān)信號(hào)通路JAK-STAT和PI3K之間的關(guān)系,揭示IL-2逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭的分子機(jī)制。結(jié)果:1,通過BCG免疫一次,結(jié)核亞單位疫苗LT70和MH加強(qiáng)免疫10次,成功建立T細(xì)胞耗竭模型。2,相比于結(jié)核抗原短暫刺激(加強(qiáng)免疫2次)組,T細(xì)胞耗竭組:細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著性降低(p0.01);CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)目顯著性減少(p0.05);TB10.44-12特異性的記憶性CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著減少(p0.05);CD4+T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1表達(dá)水平升高(p0.05);BCG和銅綠假單胞菌攻擊后清除率下降(p0.05),機(jī)體抗感染保護(hù)能力明顯下降;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細(xì)胞的數(shù)量降低,其增殖能力被抑制(p0.05)。3,應(yīng)用造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、IL-2和雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療后,相比于T細(xì)胞耗竭組,造血干細(xì)胞治療組和IL-2治療組具有逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭的作用:細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著升高(p0.05);TB10.4特異性的記憶性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量增加(p0.05);CD4+T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1表達(dá)水平下降(p0.01);BCG攻擊后,造血干細(xì)胞治療組和IL-2治療組的細(xì)菌載量顯著低于T細(xì)胞耗竭未治療組;CD34-Lin-Sca-1+CD117+造血干細(xì)胞的增殖能力恢復(fù)(p0.05)。4,通過造血干細(xì)胞增殖分化相關(guān)通路JAK-STAT和PI3K研究發(fā)現(xiàn),激酶3(Janus Kinase 3,JAK3)蛋白主要在造血細(xì)胞中表達(dá),T細(xì)胞耗竭組中骨髓造血干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT-5磷酸化水平被抑制,IL-2治療后可以恢復(fù)STAT-5的磷酸化。結(jié)論:應(yīng)用結(jié)核抗原持續(xù)刺激建立T細(xì)胞耗竭動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?該模型從一個(gè)側(cè)面說明大量細(xì)菌(抗原)刺激是結(jié)核分枝桿菌引起機(jī)體免疫功能低下的機(jī)制之一;T細(xì)胞耗竭后小鼠受特異性抗原刺激時(shí)IFN-γ等細(xì)胞因子分泌水平下降,CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目和增殖能力下降,CD4+T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1表達(dá)上調(diào),造血干細(xì)胞分化為T細(xì)胞的能力降低;應(yīng)用造血干細(xì)胞、IL-2治療后T細(xì)胞耗竭得以逆轉(zhuǎn);進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)IL-2主要通過激活JAK-STAT信號(hào)通路,使得轉(zhuǎn)錄因子STAT-5磷酸化,調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖分化,從而恢復(fù)骨髓造血干細(xì)胞向T細(xì)胞分化的能力。第二章結(jié)核分枝桿菌融合蛋白LT70的構(gòu)建及其保護(hù)效果研究結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌感染引起,是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時(shí)間最久、危害最為嚴(yán)重的傳染病之一。二十世紀(jì)八十年代以來,隨著耐藥菌株尤其是耐多藥結(jié)核菌及人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的傳播與流行,結(jié)核病在世界各地的發(fā)病率呈現(xiàn)回升趨勢(shì),發(fā)病率和死亡率高居不下。現(xiàn)階段結(jié)核病防治所使用的疫苗BCG是減毒牛分枝桿菌活疫苗。自1921年用于人類接種,能夠有效預(yù)防新生兒和兒童患嚴(yán)重的腦膜結(jié)核及全身粟粒性結(jié)核病,但是不能有效預(yù)防成人肺結(jié)核的發(fā)生。因此,新型結(jié)核疫苗的研究開發(fā)迫在眉睫。目的:通過建立針對(duì)休眠菌在內(nèi)的不同生長狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌有效的免疫應(yīng)答,提高亞單位疫苗的免疫保護(hù)效力。方法:1,本研究選用結(jié)核分枝桿菌生長期抗原ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64的190-198位的氨基酸多肽和潛伏期保護(hù)性抗原Hrp1(Rv2626c),構(gòu)建無標(biāo)簽融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)。2,該融合蛋白在大腸埃希菌E.coli BL21菌株中進(jìn)行表達(dá);通過條件優(yōu)化,使該蛋白可溶性表達(dá);進(jìn)而利用疏水柱層析和分子篩層析方法對(duì)其進(jìn)行純化。3,將純化產(chǎn)物與佐劑二甲基三十六烷基銨(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)混合制備結(jié)核亞單位疫苗LT70,分別在小鼠模型和家兔模型評(píng)價(jià)亞單位疫苗LT70免疫學(xué)效應(yīng)及保護(hù)效率,并進(jìn)行BCG初免后亞單位疫苗的強(qiáng)化免疫策略研究。結(jié)果:1,LT70融合蛋白在大腸埃希菌E.coli BL21中可溶性表達(dá),應(yīng)用疏水柱Butyl-FF層析和分子篩G-75的純化方法成功將其分離純化。2,在小鼠模型免疫學(xué)評(píng)價(jià)中,亞單位疫苗LT70誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性IFN-γ水平和抗體Ig G1、Ig G2c水平顯著高于BCG組和PBS組,具有較強(qiáng)的免疫原性。3,疫苗免疫30周后進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株氣霧攻擊,LT70疫苗顯示出較強(qiáng)的免疫保護(hù)力(5.4±0.38 Log10 CFU),其保護(hù)效果強(qiáng)于BCG(6.01±0.33 Log10CFU)和PBS組(6.53±0.26 Log10 CFU);BCG初免后亞單位疫苗LT70具有加強(qiáng)BCG的免疫效果(5.62±0.64 Log10 CFU)(p=0.26)。結(jié)論:結(jié)核亞單位LT70疫苗可誘導(dǎo)較強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答;在小鼠模型中具有較好的清除和抑制結(jié)核分枝桿菌的作用,其保護(hù)效果強(qiáng)于BCG,有望成為結(jié)核病防治的有效候選疫苗。第三章結(jié)核亞單位疫苗DPC佐劑的研究及其應(yīng)用新型結(jié)核亞單位疫苗需要佐劑輔助以誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。選擇適當(dāng)?shù)淖魟┎粌H提高免疫應(yīng)答的水平,也可以改變免疫應(yīng)答的類型。疫苗靶向細(xì)胞內(nèi)病原體如結(jié)核分枝桿菌,需要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,包括活化CD4 Th1型輔助T細(xì)胞和CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)。然而,當(dāng)前在臨床上使用的佐劑只有鋁佐劑,該佐劑可促進(jìn)Th2型體液免疫應(yīng)答,無法引起Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此,研發(fā)新的可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑對(duì)結(jié)核疫苗的發(fā)展至關(guān)重要。我們?cè)谇捌谘芯恐?以陽離子脂質(zhì)體DDA為基礎(chǔ),聯(lián)合Toll樣受體3激動(dòng)劑Poly I:C能誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和較強(qiáng)的免疫保護(hù)效果。但是佐劑DDA-Poly I:C(簡稱DP)的穩(wěn)定性較差,易發(fā)生絮凝現(xiàn)象,無法滿足臨床疫苗的需要。目的:我們?cè)谧魟〥P的基礎(chǔ)上,研究增強(qiáng)佐劑穩(wěn)定性的方法,以構(gòu)建更加穩(wěn)定和有效的新型免疫佐劑,利于后期的研發(fā)和生產(chǎn)。方法:1,以佐劑DP為基礎(chǔ),聯(lián)合不同輔料,通過粒徑和zeta電位等指標(biāo)評(píng)價(jià)佐劑的理化性狀和穩(wěn)定性,從而篩選可增強(qiáng)佐劑DP穩(wěn)定性的輔料。2,利用乳化-溶劑揮發(fā)法,將DDA和Poly I:C聯(lián)合膽固醇制成陽離子脂質(zhì)體佐劑DDA-Poly I:C-膽固醇(簡稱DPC),并與融合蛋白LT70聯(lián)合構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC。3,在C57BL/6小鼠模型上進(jìn)行LT70-DPC疫苗的免疫學(xué)評(píng)價(jià)和保護(hù)效率評(píng)價(jià):0,2,4周進(jìn)行LT70-DPC疫苗的免疫,末次免疫后6周進(jìn)行免疫指標(biāo)的檢測(cè),30周后結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株攻擊,攻擊10周后檢測(cè)保護(hù)效率。結(jié)果:1,使用膽固醇聯(lián)合DDA和Poly I:C構(gòu)建新型疫苗佐劑DPC。2,通過佐劑的理化性狀分析結(jié)果顯示新型佐劑DPC較佐劑DP粒徑由約500nm降至約400nm,大小均一;同時(shí),隨著膽固醇的加入,佐劑DP的Zeta電位由23.48(±2.93)升高至41.22(±4.04),佐劑DP的穩(wěn)定性得以明顯提升。3,將佐劑DPC與融合蛋白LT70聯(lián)合,構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC。通過C57BL/6小鼠模型進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià),結(jié)果顯示LT70-DPC疫苗和LT70-DP疫苗均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗原特異性IFN-γ水平和抗體Ig G1、Ig G2c水平,其水平顯著高于BCG組和PBS組(p0.05)。4,在小鼠保護(hù)效率實(shí)驗(yàn)中,結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力,LT70-DPC組肺部細(xì)菌載量(5.43±0.37Log10 CFU)與疫苗LT70-DP組細(xì)菌載量(5.4±0.38 Log10 CFU)相當(dāng),均低于BCG組(6.01±0.33 Log10 CFU);同時(shí),結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株攻擊后,疫苗LT70-DPC組的病理損傷面積(7.4±0.04%)顯著低于疫苗LT70-DP組(12.2±0.01%)(p0.05)。結(jié)論:新型佐劑DPC增加了佐劑DP的穩(wěn)定性,利于后期的研發(fā)和生產(chǎn);結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答;在小鼠保護(hù)效率實(shí)驗(yàn)中,疫苗LT70-DPC的保護(hù)效果強(qiáng)于BCG,且明顯降低了小鼠肺組織病理損傷,有望成為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的有效的結(jié)核亞單位疫苗佐劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33

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5 李s，

本文編號(hào)：2474078