【摘要】：肺結(jié)核是一種具有高傳染性和致死率的疾病。隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用,人們曾經(jīng)很好地控制了它的傳播,但是近年來,這一疾病再次威脅到人類的健康和生命。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計(jì),最近幾年全世界感染肺結(jié)核的人數(shù)在逐年遞增,其中有三分之一感染者死亡�？股氐拇罅渴褂檬窃斐蛇@一現(xiàn)象的主要原因。較長的治療周期和多種抗生素的聯(lián)合使用一方面給病人的身體造成了非常大的傷害,另一方面還導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的不斷增強(qiáng)。此外,與艾滋病的交叉感染也是導(dǎo)致其死亡率逐年上升的原因之一。艾滋病病毒會對人體的免疫系統(tǒng)造成傷害,艾滋病患者也就更容易感染肺結(jié)核,感染后的患者很難治愈,通常在幾個(gè)月后就會死亡�？ń槊�(BCG)是預(yù)防結(jié)核病的唯一疫苗,但是在許多地區(qū)它對結(jié)核病的保護(hù)力從0到80%不等,對于有免疫缺陷的病人,BCG接種還有可能導(dǎo)致結(jié)核的全身播散。因此,人們需要研究開發(fā)更為安全、有效的疫苗來預(yù)防結(jié)核病的傳播。到目前為止,科學(xué)家們也研發(fā)了一些新的肺結(jié)核候選疫苗,它們的免疫效果已經(jīng)通過臨床前的動物實(shí)驗(yàn)證明,個(gè)別候選疫苗已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ或Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn),但是這些疫苗都以蛋白或肽作為抗原決定基。與蛋白或多肽疫苗相比,糖綴合物疫苗具有很大的優(yōu)勢：首先,多糖類物質(zhì)一般都存在于細(xì)胞表面,這就可以保證人體在受到細(xì)菌感染的過程中能夠快速識別并產(chǎn)生免疫反應(yīng)；其次,糖的結(jié)構(gòu)具有高度的保守性,不會像蛋白質(zhì)和核酸那樣容易發(fā)生變異,接種糖疫苗后可能會達(dá)到終身免疫的效果；另外,研究證明多糖類物質(zhì)具有非常重要的生物功能,尤其是在細(xì)菌感染人體的最初階段。在許多已經(jīng)上市的基于糖抗原的疫苗中(如肺炎鏈球菌疫苗、B型流感嗜血桿菌疫苗、C群腦膜炎球菌多糖綴合物疫苗等),糖抗原已經(jīng)被證明是一種非常重要的抗原組分,因此我們相信基于糖抗原的肺結(jié)核疫苗的研究是非常重要的。脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)是結(jié)核桿菌細(xì)胞表面的一種非常重要的脂多糖。研究證明,LAM在結(jié)核桿菌感染人體的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。例如,它能抑制γ-干擾素介導(dǎo)的活化、巨噬細(xì)胞活化、觸發(fā)和殺傷活性、T-細(xì)胞活化等,這些都和免疫反應(yīng)息息相關(guān)。因此,LAM是研發(fā)肺結(jié)核疫苗的良好靶抗原。為此,我們設(shè)計(jì)了三個(gè)源自LAM非還原端的阿拉伯寡糖片段,其結(jié)構(gòu)中都含有α-(1→2)連接的吡喃型甘露二糖。并通過合理的路線設(shè)計(jì),以化學(xué)手段立體選擇性的合成了這些寡糖半抗原,然后與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和單磷酰類脂A(MPLA)綴合得到LAM寡糖-綴合物候選疫苗,最后對疫苗的免疫活性進(jìn)行了初步測試。本論文主要包括以下三個(gè)部分：一、對結(jié)核桿菌LAM寡糖及其衍生物的合成與性能研究做了詳細(xì)的綜述。(1)PIM寡糖的合成。其主要合成思路大體類似,根據(jù)肌醇上六個(gè)羥基的反應(yīng)活性不同,經(jīng)過合理的保護(hù)基策略和路線設(shè)計(jì),首先合成特定位置羥基裸露的肌醇衍生物作為受體,然后與不同的甘露糖供體進(jìn)行糖苷化,最后進(jìn)行肌醇特定位置的磷酸化得到全保護(hù)的PIM衍生物,脫去全部保護(hù)基得到終產(chǎn)物。(2)LAM阿拉伯寡糖的合成。阿拉伯寡糖片段中含有α-(1→5)、α-(1→3)以及β-(1→2)等連接方式,其合成也相對比較困難,所以大部分研究主要集中在β-(1→2)連接的阿拉伯糖苷鍵的合成方法學(xué)上,主要包括：分子內(nèi)轉(zhuǎn)移法、利用構(gòu)像限制作用選擇合適的保護(hù)基、氫鍵誘導(dǎo)法等等。(3)LAM小分子類似物的合成。由于LAM結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,其衍生物的合成也是非常困難的,只有少數(shù)人設(shè)計(jì)合成了非常簡單的分子,且多數(shù)都沒有涉及到β-(1→2)連接的阿拉伯糖苷鍵的構(gòu)建。二、LAM阿拉伯寡糖-蛋白綴合物的合成。(1)LAM非還原端四糖的合成：該合成以D-阿拉伯糖和D-甘露糖為起始原料,采用[2+2]的糖苷化策略,通過構(gòu)建甘露二糖供體和阿拉伯二糖受體來實(shí)現(xiàn)。在合成阿拉伯二糖時(shí),反應(yīng)生成α和β異構(gòu)體的混合物,目標(biāo)產(chǎn)物通過硅膠柱分離純化,其構(gòu)型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學(xué)位移確定。在合成四糖時(shí)也得到了α和β異構(gòu)體的混合物,產(chǎn)物也可以很容易地通過硅膠柱分離,其構(gòu)型根據(jù)甘露糖異頭碳的1JCH耦合常數(shù)確定。(2)LAM七糖的合成：該合成采用[5+2]的糖苷化策略,充分利用乙酰基的鄰基參與作用控制立體選擇性,且由于α和β異構(gòu)體是在合成供體的過程中產(chǎn)生的,避免了在最后階段糖苷化生成異構(gòu)體,關(guān)鍵中間體的構(gòu)型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學(xué)位移確定。(3)LAM十一糖的合成：與七糖的合成類似,該合成采用了[9+2]的糖苷化策略。在合成供體的過程中通過雙糖苷化的方法快速構(gòu)建分枝型阿拉伯糖苷鍵,整個(gè)路線同樣充分利用了乙�；泥徎鶇⑴c作用控制立體選擇性,只有一步反應(yīng)產(chǎn)生α和β異構(gòu)體,其構(gòu)型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學(xué)位移確定。(4)寡糖與BSA和KLH的綴合：以雙琥珀酰亞胺戊二酸酯為交聯(lián)劑進(jìn)行。糖蛋白綴合物的糖含量用硫酸-苯酚法分析計(jì)算得到,且BSA綴合物的糖含量可以進(jìn)一步通過MALDI-TOF質(zhì)譜確定,KLH綴合物的糖含量通過SDS-PAGE分析確定。(5)LAM寡糖-KLH綴合物的初步免疫結(jié)果表明,三個(gè)寡糖綴合物均能夠引起特異性的免疫反應(yīng),產(chǎn)生一定滴度的抗體。三、LAM阿拉伯寡糖-MPLA綴合物的合成。最初我們計(jì)劃將寡糖連接在MPLA的6’-O位置,通過將6’位羥基衍生化引入炔基,接著和含有疊氮基的LAM寡糖經(jīng)過點(diǎn)擊化學(xué)"click"反應(yīng)完成綴合。我們首先采用收斂的策略高效的合成了6’位羥基的MPLA衍生物,接著和溴丙炔在氫化鈉存在的條件下反應(yīng)引入炔丙基,但是經(jīng)過核磁共振二維譜圖鑒定,MPLA4'-O位的磷脂酰基遷移到了6’-O位,而炔丙基被引入到了4’-O位置。后來我們嘗試用戊炔酸與6’位羥基縮合成酯,但是發(fā)現(xiàn)酯鍵穩(wěn)定性較差,容易水解斷開。為了解決這一難題,我們將6’位羥基換成氨基,然后與戊炔酸縮合形成穩(wěn)定的酰胺鍵,接著與LAM四糖經(jīng)過"click"反應(yīng)綴合,最后脫去全部保護(hù)基得到LAM寡糖-MPLA綴合物。此外,我們還合成了1-O位連接的LAM四糖-MPLA綴合物作為陽性對比。糖脂類化合物的質(zhì)譜分析一直是令人們頭痛的問題,這類化合物難于離子化,需要通過特殊的質(zhì)譜條件才能完成。我們采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對所合成的綴合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析,其中6’位連接的四糖-MPLA綴合物以2,5-二羥基苯甲酸(DHB)為基質(zhì),三氟乙酸(TFA)為離子化試劑,在reflection-負(fù)離子模式下分析,1-O位連接的四糖-MPLA綴合物以6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)為基質(zhì),檸檬酸銨為離子化試劑,在linear-負(fù)離子模式下分析,獲得了滿意的結(jié)果。最后,我們還對兩個(gè)四糖-MPLA綴合物進(jìn)行了初步的免疫實(shí)驗(yàn)評價(jià),結(jié)果表明它們都能夠引起特異性的免疫反應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
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本文編號：2459711