【摘要】：白念珠菌(Candida albicans)是一種常見(jiàn)的人體病原真菌,存在于大部分正常人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道等黏膜組織和臟器中,是一種機(jī)會(huì)性致病真菌。通常情況下白念珠菌不會(huì)引起人體疾病,當(dāng)機(jī)體免疫功能或一般防御力下降、以及宿主體內(nèi)正常菌群相互制約作用失衡時(shí),則會(huì)引起念珠菌病。近年來(lái),隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)(如免疫抑制和器官移植等)的廣泛應(yīng)用,白念珠菌感染的比例呈現(xiàn)出明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)。白念珠菌能夠成為人體內(nèi)成功的條件性致病真菌的一個(gè)重要原因是它具有形態(tài)可塑性(phenotypic plasticity)這樣一個(gè)顯著特征。這種形態(tài)可塑性體現(xiàn)在白念珠菌能夠以不同形態(tài)存在,比如,酵母形態(tài)、菌絲形態(tài)、white和opaque形態(tài)等。在一定的條件下,白念珠菌可以在不同的形態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換,以更好的適應(yīng)環(huán)境的變化。最為典型的兩種形態(tài)轉(zhuǎn)變系統(tǒng)為酵母(Yeast)-菌絲(Filaments)、white-opaque之間的相互轉(zhuǎn)換。白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,這種形態(tài)轉(zhuǎn)換與白念珠菌的致病性是直接相關(guān)的。因此,深入研究白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換分子機(jī)理將有助于更好的認(rèn)識(shí)其致病機(jī)理,有助于未來(lái)對(duì)念珠菌病的治療提供新的思路。本研究以揭示白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理為目的,對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Off1以及高親和性鐵離子滲透酶Ftr1和Ftr2在白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的調(diào)控作用進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下：1.OFI1基因的分子特征及其表達(dá)譜分析白念珠菌的基因orf 19.4972 (GeneBank accession:68467498)是一個(gè)功能未知基因,我們將之命名為OFI1 (opaque and filamentation inducer 1)。其ORF框編碼含有648個(gè)氨基酸殘基的蛋白,其分子量為71262 Da,等電點(diǎn)為9.41。通過(guò)對(duì)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),Ofil蛋白含有3個(gè)串聯(lián)的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)基序(ZnF_ C2H2, aa97-119, aa 125-147, and aa 153-173),表明Off1具有結(jié)合DNA的能力。通過(guò)對(duì)多個(gè)包括microarray和RNAseq在內(nèi)的高通量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),orf9.4972在白念珠菌opaque細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平均高于white細(xì)胞。利用RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示opaque田胞中OFI1的表達(dá)水平是white細(xì)胞中OFI1表達(dá)水平的近120倍。2.Ofil在白念珠菌white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換中的功能通過(guò)將OFI1基因置于ACT1啟動(dòng)子下進(jìn)而構(gòu)建了過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,將質(zhì)粒線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)入白念珠菌野生型菌株WUM5A中構(gòu)建了OFI1過(guò)表達(dá)菌株,并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)菌株中OFI1的表達(dá)水平顯著性的高于對(duì)照菌株的相同形態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)水平。隨之,進(jìn)行了white-opaque轉(zhuǎn)換頻率實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,在野生型細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OFI1后,在Lee's Glucose以及Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后,白念珠菌opaque形成的比例都顯著性地增強(qiáng),也就是white向opaque轉(zhuǎn)換的頻率增加了,尤其是在Lee's GlcANc培養(yǎng)基上,OFI1過(guò)表達(dá)使得白念珠菌幾乎100%地由white細(xì)胞變?yōu)閛paque形態(tài)的細(xì)胞。但是opaque向white轉(zhuǎn)換的頻率卻沒(méi)有因?yàn)镺FI1的過(guò)表達(dá)而受到顯著的影響,暗示OFI1的過(guò)表達(dá)對(duì)于將細(xì)胞維持在opaque狀態(tài)的作用并不大。關(guān)鍵基因WOR1的敲除使得白念珠菌很難由white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換,細(xì)胞被鎖定在white狀態(tài)。為了進(jìn)一步確定OFI1與WORl的關(guān)系,我們?cè)赪OR1缺失株中過(guò)表了OFI1基因,white-opaque轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在缺失關(guān)鍵調(diào)控因子Wor1的情況下,OFI1的過(guò)表達(dá)并不能恢復(fù)細(xì)胞由white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的能力。因此,Off1可能并不能單獨(dú)行使對(duì)這種形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)功能,而是需要與其它受到Wor1調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子一起才能發(fā)揮作用。此外,還構(gòu)建了OFI1基因的缺失株及其回補(bǔ)菌株,通過(guò)統(tǒng)計(jì)white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)化頻率發(fā)現(xiàn),OFIl基因的缺失雖然不能夠阻止white向opaque形態(tài)的轉(zhuǎn)換,但是在Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上,其缺失能夠降低white向opaque的轉(zhuǎn)換頻率,這與OFI1基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)white向opaque轉(zhuǎn)換的結(jié)果是一致的。但是,無(wú)論是過(guò)表達(dá)OFI1還是敲除OFI1,其對(duì)opaque形態(tài)的維持并不是那么重要,對(duì)opaque向white的轉(zhuǎn)變頻率沒(méi)有顯著性影響。綜合這些結(jié)果,OFI1對(duì)white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)功能雖然沒(méi)有基因WOR1的功能強(qiáng),但是它在整個(gè)white-opaque形態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中占有自己的位置,與其它功能還未知的調(diào)控因子一起,影響著white-opaque的形態(tài)轉(zhuǎn)換,對(duì)其進(jìn)行微調(diào)的作用。3.Ofi1在白念珠菌菌絲生長(zhǎng)和侵入性生長(zhǎng)過(guò)程中的作用除了對(duì)Off1在white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換中的功能研究,我們還對(duì)Off1在白念珠菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中是否發(fā)揮作用進(jìn)行了研究。同樣的,在野生對(duì)照株CAI4中過(guò)表達(dá)了OFI1,并在不同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件包括三種培養(yǎng)基(Lee's Glucose、Lee's GlcNAc和Spider)和三種溫度條件(25℃、30℃和37。C)。低溫25。C不宜于菌絲的生長(zhǎng)。在25℃培養(yǎng)條件下,在Lee's Glucose培養(yǎng)基和Spider培養(yǎng)基上,OFI1的過(guò)表達(dá)顯著性的促進(jìn)了菌絲的生長(zhǎng)。30℃培養(yǎng)條件下,在Lee's Glucose和Spider培養(yǎng)基上,OFI1的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng),但由于GlcNAc是促進(jìn)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子,在Lee'GlcNAc培養(yǎng)基上,對(duì)照菌株的菌絲也呈現(xiàn)出大量的生長(zhǎng),很難比較過(guò)表達(dá)菌株與對(duì)照菌株的菌絲生長(zhǎng)能力。高溫37。C是白念珠菌容易進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)的溫度條件,在37。C培養(yǎng)條件下,所有培養(yǎng)基上的對(duì)照菌株均能進(jìn)行大量的菌絲生長(zhǎng),難以區(qū)別對(duì)照菌株和OFI1過(guò)表達(dá)菌株菌絲生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱。在WOR1基因突變體中過(guò)表達(dá)OFI1是不能促進(jìn)white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的,因此OFI1過(guò)表達(dá)對(duì)white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)變的促進(jìn)作用是依賴(lài)于WOR1的。OFI1過(guò)表達(dá)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用是否也是依賴(lài)于WOR1?基于這樣的問(wèn)題,我們對(duì)wor1-/-突變體中過(guò)表達(dá)了OFI1的菌株進(jìn)行了菌絲生長(zhǎng)能力實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示在Spider培養(yǎng)基上,不論是25℃培養(yǎng)還是30℃培養(yǎng),wor1-/-突變株中過(guò)表達(dá)OFI1能夠非常明顯的促進(jìn)菌絲的形成；Lee's Glucose培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)條件下,在worl-/-突變體中過(guò)表達(dá)OFI1對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不大,但是30℃培養(yǎng)條件下,過(guò)表達(dá)菌株菌絲的生長(zhǎng)能力強(qiáng)于對(duì)照菌株。而在Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上過(guò)表達(dá)菌株和對(duì)照株的菌絲生長(zhǎng)能力都很強(qiáng)。因此,過(guò)表達(dá)OFI1能夠在一定的條件下促進(jìn)菌絲生長(zhǎng),并且這種促進(jìn)作用是不依賴(lài)于WOR1基因的表達(dá)。但是,通過(guò)對(duì)OFI1缺失菌株和回補(bǔ)株進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在各個(gè)不同培養(yǎng)條件下,該基因的缺失對(duì)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)并不能產(chǎn)生顯著性影響,因此OFI1基因并不是菌絲生長(zhǎng)所必須的。白念珠菌侵入生長(zhǎng)的能力被認(rèn)為是感染宿主初期時(shí)穿透組織所需要的。菌絲的生長(zhǎng)與其侵入生長(zhǎng)能力是密切相關(guān)的。為了驗(yàn)證這一點(diǎn),我們對(duì)過(guò)表達(dá)菌株的侵入生長(zhǎng)能力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示在25℃培養(yǎng)條件下,OFI1過(guò)表達(dá)菌株的侵入生長(zhǎng)能力顯著性增強(qiáng)。但是在30℃和37℃度的條件下,所有菌株都能進(jìn)行侵入生長(zhǎng),因此OFIl過(guò)表達(dá)對(duì)菌株侵入生長(zhǎng)的影響在較低溫度下更加顯著。4.高親和性鐵離子滲透酶Ftrl和Ftr2調(diào)控白念珠菌生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生微量元素鐵對(duì)于幾乎所有生物的生長(zhǎng)都是必須的。白色念珠不僅能生存于鐵含量豐富的環(huán)境,比如人體腸道系統(tǒng),還能生存于鐵含量極低的環(huán)境,比如血液中。Ftr1和Ftr2是目前已知的白念珠菌中兩種對(duì)鐵離子具有高親和性的滲透酶,分別編碼381和382個(gè)氨基酸的蛋白。兩者具有高達(dá)83%的同源性,含有多個(gè)跨膜區(qū)和鐵離子結(jié)合區(qū),但其生物學(xué)特性卻并不相同。FTR1在鐵含量受限的時(shí)候表達(dá)量升高,而在鐵含量比較豐富的情況下其表達(dá)水平是被抑制的；FTR2的表達(dá)情況正好相反。在低鐵環(huán)境中,僅Ftr1行使高親和性鐵攝取活性,并對(duì)白念珠菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,此外,Ftrl對(duì)于白念珠菌感染宿主并產(chǎn)生毒性非常關(guān)鍵,該基因的缺失使得菌株不能有效地對(duì)宿主產(chǎn)生感染。而Ftr2對(duì)白念珠的生理活動(dòng)及毒理效應(yīng)并不清楚。環(huán)境中鐵的豐度對(duì)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)、腸道中共生及致病能力都有一定的影響。但是,目前對(duì)高親和性鐵離子滲透酶在白念珠菌菌絲生長(zhǎng)中的功能還沒(méi)有進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的研究。Ftrl和Ftr2與菌絲生長(zhǎng)是否存在相關(guān)性,并未可知。我們對(duì)FTR1、FTR2基因缺失株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況以及菌絲生長(zhǎng)能力進(jìn)行分析,明確了高親和性鐵離子滲透酶在白念珠菌生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生中的功能。通過(guò)將不同基因型的菌株分別置于不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度下進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)其生長(zhǎng)速度以及菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示,在所有測(cè)試過(guò)的培養(yǎng)條件下,FTR1或FTR2單基因缺失對(duì)于白念珠菌的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的影響,但是FTR1、FTR2雙基因缺失使白念珠菌在Spider培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),鐵離子的添加能夠恢復(fù)該雙基因缺失株的生長(zhǎng)能力；FTR1、FTR2雙基因缺失株在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度也較慢；ftr1/frt1菌株的菌絲生長(zhǎng)能力增強(qiáng),而ftr2/ftr2菌株的菌絲生長(zhǎng)能力減弱。雙基因突變株ftr1/ftr1 ftr2/ftr2的菌絲生長(zhǎng)能力能夠恢復(fù)到野生對(duì)照株的水平。這些結(jié)果提示Ftrl對(duì)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用,Ftr2對(duì)菌絲生長(zhǎng)起正調(diào)控作用。同時(shí),Ftrl與Ftr2不僅對(duì)白念珠菌在微量鐵元素環(huán)境中的生存有著重要的作用,還參與了白念珠菌對(duì)碳源N-乙酰葡萄糖胺、乙醇和甘油等的利用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R379.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2455917