【摘要】：本研究旨在制備具有功能活性的重組人血小板表面CD36抗原的鼠抗人單克隆抗體。提取人肝細(xì)胞總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增編碼人血小板CD36抗原胞外區(qū)(Gly30-Asn439)氨基酸殘基cDNA,構(gòu)建于原核表達(dá)載體pMD18并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選獲得陽(yáng)性重組子pMD18-CD36,提取質(zhì)粒。經(jīng)序列測(cè)定后,將該基因插入到真核細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)載體pTE2上,構(gòu)建成為pTE2-s-CD36-10 His真核瞬時(shí)表達(dá)載體。采用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+2NTA柱層析純化。以制備的重組CD36蛋白免疫BALB/c小鼠后,取脾與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選出陽(yáng)性克隆,行Western blot檢測(cè)抗體結(jié)合活性。結(jié)果顯示:RT-PCR擴(kuò)增獲得了1.4 kb的片段。經(jīng)測(cè)序,該序列分析結(jié)果與GenBank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE證實(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞表達(dá)了人CD36抗原胞外區(qū)蛋白片段。鼠單克隆抗體在Western blot中可以識(shí)別重組CD36蛋白,靈敏度達(dá)到8 ng。結(jié)論:成功制備了抗人血小板CD36單克隆抗體,為臨床篩選CD36陰性患者及獻(xiàn)血員、深入研究人血小板CD36表面抗原對(duì)血小板輸注無(wú)效的影響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:The aim of this study was to prepare murine anti-human monoclonal antibodies against CD36 antigen on the surface of recombinant human platelets with functional activity. The total RNA, extracted from human hepatocytes was amplified by RT-PCR and encoded by the amino acid cDNA, encoding the extracellular domain of human platelet CD36 antigen (Gly30-Asn439). The cDNA, was constructed into the prokaryotic expression vector pMD18 and transformed into Escherichia coli DH5 偽, and the pMD18-CD36, extraction plasmid of the positive recombinant plasmid was obtained. After sequencing, the gene was inserted into eukaryotic cell transient expression vector pTE2 and constructed as pTE2-s-CD36-10 His eukaryotic transient expression vector. The recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by lipofectamine 2000 transfection, and the expressed product was purified by Ni2 2NTA column chromatography. After immunizing BALB/c mice with recombinant CD36 protein, the spleen was fused with mouse myeloma cells, and the positive clones were screened out. The antibody binding activity was detected by Western blot. The results showed that 1. 4 kb fragment was obtained by RT-PCR amplification. The sequence analysis was consistent with the NM_001001547.2 in GenBank. SDS-PAGE confirmed that the transfected HEK293 cells expressed the extracellular domain protein fragment of human CD36 antigen. Mouse monoclonal antibody can recognize recombinant CD36 protein in Western blot, and its sensitivity is up to 8 ng.. Conclusion: monoclonal antibodies against human platelet CD36 were successfully prepared, which provided experimental basis for clinical screening of CD36 negative patients and blood donors and further study of the effect of human platelet CD36 surface antigen on platelet transfusion.
【作者單位】： 解放軍總醫(yī)院輸血科 解放軍臨床輸血中心;北京義翹神州生物技術(shù)有限公司;
【基金】：國(guó)家衛(wèi)生部課題,編號(hào)201002005
【分類(lèi)號(hào)】：R331.143

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王欣;陳瑩;陳杰;;小鼠CD36基因片段合成、表達(dá)及GST融合蛋白的表達(dá)和純化[J];中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周毅,石錦萍,黃秀深,高麗元,隆素芬,陳潔;烏三顆�？鼓[瘤作用及對(duì)荷瘤小鼠造血功能的影響[J];成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2003年01期

2 肖樺,黃秀鳳,李艷,陳潔;異功化瘤顆粒對(duì)Lewis肺癌的抑制作用[J];成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2004年01期

3 劉廣超,姚亞利,石淵淵,張曉紅,周柔麗;人血清對(duì)腫瘤細(xì)胞凝集的影響[J];河南腫瘤學(xué)雜志;1998年04期

4 劉廣超,李淑梅,張曉紅,石淵淵;血清影響腫瘤血行轉(zhuǎn)移的探討[J];河南腫瘤學(xué)雜志;1999年05期

5 劉廣超,張進(jìn)忠,石淵淵,張曉紅;豬紅細(xì)胞膜糖肽抑制腫瘤的血行轉(zhuǎn)移[J];河南醫(yī)學(xué)研究;1999年03期

6 劉廣超,翟慶云,石淵淵,王玉蘭;血清凝集腫瘤細(xì)胞活性及其意義的研究[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2001年02期

7 李曉冬;張雅芳;周顯禮;劉慧冬;趙玲輝;;血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1在大鼠結(jié)腸癌組織及淋巴管的表達(dá)[J];解剖學(xué)報(bào);2007年05期

8 劉廣超,李淑梅,周柔麗,姚亞利,張曉紅;血清腫瘤細(xì)胞凝集因子生化特性的研究[J];開(kāi)封醫(yī)專(zhuān)學(xué)報(bào);1998年02期

9 劉廣超,姚亞莉,張曉紅,李淑梅,周柔麗;血清凝集腫瘤細(xì)胞活性檢測(cè)對(duì)惡性腫瘤診斷的意義[J];開(kāi)封醫(yī)專(zhuān)學(xué)報(bào);1998年03期

10 劉廣超,石淵淵,姚亞利,孟民杰,許平輝;豬紅細(xì)胞膜糖肽抗腫瘤作用的初步研究[J];開(kāi)封醫(yī)專(zhuān)學(xué)報(bào);1998年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 羅振亮;肺癌瘀血舌象特征及凝血機(jī)制相關(guān)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

2 侯瑞珍;RGD序列肽的合成、脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤作用的研究[D];吉林大學(xué);2007年

3 雒琳;新加良附方抑制小鼠移植性肝癌效應(yīng)與機(jī)制研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2008年

4 李墨林;化療治愈腫瘤動(dòng)物模型的建立及小劑量CTX抗腫瘤作用機(jī)制的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

5 陳小軍;達(dá)肝素鈉對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞體外生長(zhǎng)狀態(tài)的影響及機(jī)制探討[D];山東大學(xué);2008年

6 牛紀(jì)曉;細(xì)胞粘附分子與血小板在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

7 劉合利;SIPA1通過(guò)下調(diào)Rap1-ERK通路抑制HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[D];中南大學(xué);2010年

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馮潤(rùn);孫堅(jiān);王農(nóng)榮;楊斌;何士勤;;甲型流感病毒核蛋白基因的真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)[J];江西醫(yī)藥;2010年01期

2 湯育新;蔣先鎮(zhèn);文甲明;陳厚仰;陽(yáng)建福;肖小旺;戴英波;;人睪丸基因TDRG1重組真核載體的構(gòu)建及其表達(dá)[J];中國(guó)男科學(xué)雜志;2010年08期

3 程曉剛,粟永萍,羅成基,劉曉宏;C-Jun蛋白對(duì)糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活能力的影響[J];免疫學(xué)雜志;2005年S1期

4 劉玉;辛?xí)匝?毛敬;張濰;;乙酰肝素酶shRNA雙基因共表達(dá)真核載體的構(gòu)建和篩選[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年01期

5 李全忠;CD36抗原與動(dòng)脈粥樣硬化[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;1999年01期

6 王瑋蓁,孔繁榮,朱學(xué)駿,陳洪,周向昭;蛋白表達(dá)在支原體研究中的應(yīng)用[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;1999年04期

7 李曉丹,李進(jìn);UV-C誘導(dǎo)的體外凋亡SMC內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)的研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)分校學(xué)報(bào);1999年01期

8 馬文彬!100044,馮百芳!100044;丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2000年06期

9 程芳洲,李庚山,余細(xì)球,唐國(guó)華,肖立新,周云;微量去甲腎上腺素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J];中華老年心腦血管病雜志;2002年01期

10 常平,朱德新,杜江,封志純;恙蟲(chóng)病東方體Karp株相對(duì)分子質(zhì)量為47蛋白基因的克隆與表達(dá)[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2005年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉執(zhí)玉;高杰;田鏵;畢玉順;;VEGF-C基因真核載體的構(gòu)建研究[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

2 劉杰;;HMGB1通過(guò)抑制Kv4基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)下調(diào)心肌瞬間外向鉀電流[A];中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)第九屆全國(guó)代表大會(huì)及學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2010年

3 楊桂棠;韓雅玲;康建;閆承慧;;E1A激活基因阻遏子在小鼠胚胎發(fā)育中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

4 賴(lài)西南;黃暉;;SP對(duì)表皮干細(xì)胞β-連環(huán)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用[A];第七屆全國(guó)創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

5 黃新莉;凌亦凌;周君琳;戴鴻雁;艾潔;;CCK-8對(duì)ES大鼠肺組織HO-1的表達(dá)的影響及機(jī)制探討[A];第六次全國(guó)缺氧和呼吸病理生理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

6 吳群;鄭芳;姜小丹;馮瑋;熊平;劉君炎;龔非力;;人類(lèi)自然殺傷細(xì)胞中syntaxin 4和SNAP-23蛋白表達(dá)、定位和相互作用[A];湖北省暨武漢市免疫學(xué)會(huì)第八屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

7 潘夕春;丁國(guó)富;周紅;;人TLR9受體LRR8片段在大腸桿菌中的重組表達(dá)[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)化療藥理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第九屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2008年

8 郜攀;黃嵐;郭瑞威;;B型利鈉肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞趨化因子-1蛋白表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

9 張磊;費(fèi)舟;李兵;趙永更;程光;;培養(yǎng)神經(jīng)元機(jī)械性損傷谷氨酸、γ-氨基丁酸含量與Homer蛋白表達(dá)變化和關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

10 蔣玉鳳;;結(jié)核分支桿菌抗原ESAT-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)的鑒定[A];中國(guó)防癆雜志2003第25卷增刊——2003年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者謝衛(wèi)群;中國(guó)完成SARS病毒主要基因克隆和蛋白表達(dá)[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2003年

2 胡德榮;生物體內(nèi)痛覺(jué)誘發(fā)和維持新機(jī)制被揭示[N];健康報(bào);2008年

3 通訊員 肖鑫 記者 朱智堂;曹雪濤等發(fā)現(xiàn)新型免疫分子[N];健康報(bào);2000年

4 通訊員 朱智堂 肖鑫;我國(guó)免疫學(xué)研究取得重要進(jìn)展[N];科技日?qǐng)?bào);2000年

5 記者 駱紅初;隔離SARS與人體“第三者”露面 全球首個(gè)人源抗體基因庫(kù)建成[N];上�？萍紙�(bào);2003年

6 肖鑫 邵逸;我國(guó)發(fā)現(xiàn)新型免疫分子全長(zhǎng)基因[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

7 ;吲哚美辛誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡過(guò)程中伴有β－catenin／c－myc信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

8 任滬生;我國(guó)試用核酸干擾技術(shù)治療乳腺癌[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2004年

9 ;As_(2)S_(2)與STI571協(xié)同誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

10 ;無(wú)糖對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞損傷的影響[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王昱;AngⅡ-p22phox-ROS信號(hào)通路對(duì)大鼠高氧肺損傷的調(diào)控及與主動(dòng)修復(fù)基因hOGG_1相關(guān)性的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

2 何津巖;人類(lèi)p100蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

3 曲銀娥;COXⅦa在中老年男子部分雄激素缺乏綜合征中的作用及機(jī)理研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

4 李燕;沙眼衣原體Pmp蛋白的表達(dá)純化及其臨床檢測(cè)的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

5 吳春風(fēng);抗人誘騙受體3多克隆抗體、單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

6 賈雪梅;艾滋病毒Vpr蛋白抑制KSHV裂解性周期復(fù)制：GSK-3β信號(hào)通路的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

7 杜昆;沙眼衣原體CT703蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)及功能初探[D];中南大學(xué);2011年

8 馮國(guó)和;乙腦病毒prME與E蛋白編碼基因的構(gòu)建、表達(dá)及DNA免疫的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2002年

9 李軍;類(lèi)固醇受體輔活化子-3在炎癥/免疫反應(yīng)中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

10 劉莉;四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子機(jī)制及人ALT同工酶分子克隆、蛋白表達(dá)、純化及相關(guān)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 賈小英;組織蛋白酶L介導(dǎo)Ox-LDL誘導(dǎo)單層HUVECs通透性增加及其機(jī)制探討[D];南華大學(xué);2012年

2 王燕;PIG11誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的初步探討[D];南華大學(xué);2010年

3 覃健敏;IGF-1R基因多態(tài)性及p16、p21蛋白水平與巴馬長(zhǎng)壽關(guān)系的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

4 謝奎;CHO細(xì)胞在Tubespin中的培養(yǎng)工藝及其代謝分析[D];暨南大學(xué);2011年

5 何濤;SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)、純化和鑒定及中國(guó)家養(yǎng)果子貍類(lèi)SARS-CoV病毒的血清學(xué)檢測(cè)[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所）;2005年

6 左旭;血管緊張素Ⅱ?qū)CNQ1/KCNE1鉀通道蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

7 王旭榮;SEDL基因重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)hFOB1.19細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

8 李建娜;SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白的基因表達(dá)及DNA疫苗構(gòu)建[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 汪猜;人巨細(xì)胞病毒（HCMV）pp65基因的克隆、原核表達(dá)及抗原性研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

10 王喜;重組人糖皮質(zhì)激素受體原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

，

本文編號(hào)：2408308