【摘要】：目的肝臟是機(jī)體內(nèi)非常重要的代謝器官,承擔(dān)機(jī)體物質(zhì)轉(zhuǎn)化、糖原合成和解毒等功能。由于含有大量天然和獲得性免疫細(xì)胞,肝臟也是非常特殊的免疫器官。在胚胎時(shí)期,胎肝是最重要的造血器官之一,而在出生后,造血干細(xì)胞及造血過(guò)程幾乎全轉(zhuǎn)移到骨髓,骨髓成為最主要和最重要的造血器官,能生成和維持全身的血細(xì)胞。而肝臟的造血功能逐漸降低,但是最近研究顯示,成年后肝臟中仍然存在少量造血干細(xì)胞。移植轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)證明,這些肝臟造血干細(xì)胞保留了一定的造血能力,可以分化發(fā)育到各種成熟免疫細(xì)胞。成年肝臟的造血干細(xì)胞是肝臟中發(fā)育分化而來(lái)還是來(lái)源于骨髓,以及在某些病理狀態(tài)下尤其是骨髓功能抑制時(shí),可否在一定程度上提供代償性的造血作用,這些問(wèn)題值得關(guān)注。造血干細(xì)胞發(fā)揮造血功能依賴于造血微環(huán)境,骨髓微環(huán)境中存在許多調(diào)控造血過(guò)程的細(xì)胞和因子。作為天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答等過(guò)程中重要的細(xì)胞因子,γ干擾素(interferon-gamma,IFN-γ)被報(bào)道參與骨髓的造血調(diào)控,包括調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的形成過(guò)程、增殖能力、自我更新及分化發(fā)育。那么,IFN-γ在肝臟微環(huán)境中是否也對(duì)肝臟造血干細(xì)胞的存活或者發(fā)育分化具有一定的影響呢?本課題針對(duì)此問(wèn)題設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn),并同時(shí)以骨髓作為參照對(duì)比,首先通過(guò)半固體培養(yǎng)基集落形成實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)了 IFN-γ確實(shí)對(duì)肝臟單個(gè)核細(xì)胞和造血干細(xì)胞(LSK細(xì)胞)集落形成能力有抑制作用,同時(shí)缺失IFN-y的小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞具有更強(qiáng)的集落形成能力。其次,我們進(jìn)一步通過(guò)多色流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比正常小鼠、IFN--γ缺失小鼠和體內(nèi)過(guò)表達(dá)IFN-γ小鼠的肝臟造血干細(xì)胞和淋巴系祖細(xì)胞以及T細(xì)胞分化方向的各細(xì)胞群的差別。最后,我們通過(guò)體外IFN-y直接刺激純化的造血干細(xì)胞,來(lái)觀測(cè)IFN-γ是否直接影響造血干細(xì)胞的增殖、凋亡以及向T細(xì)胞方向的分化發(fā)育。方法1.分離肝臟、骨髓單個(gè)核細(xì)胞,或者用流式細(xì)胞術(shù)分選出LSK(Lin-Sca-1+c-Kit+)細(xì)胞,培養(yǎng)于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中,觀察形成的集落數(shù)及集落大小。2.分離IFN-y缺失鼠、野生鼠的肝臟和骨髓單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中,觀察形成的集落數(shù)及集落大小。3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)比IFN-γ缺失鼠和野生鼠肝臟中各群造血干細(xì)胞比例的變化,及其與骨髓中造血干細(xì)胞的差別。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFN-y缺失鼠和野生鼠肝臟及骨髓中淋巴系祖細(xì)胞、T前體細(xì)胞及γδT細(xì)胞比例的差別。5.通過(guò)尾靜脈高壓注射的方法建立肝臟過(guò)表達(dá)IFN-y模型。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)比肝臟過(guò)表達(dá)IFN-γ小鼠和野生鼠肝臟及骨髓中各群造血干細(xì)胞比例差別。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)比體內(nèi)過(guò)表達(dá)IFN--γ小鼠和野生鼠肝臟及骨髓中淋巴系祖細(xì)胞、T前體細(xì)胞及γδT細(xì)胞比例情況。7.流式細(xì)胞術(shù)分選出LSK細(xì)胞,與OP9-DL1細(xì)胞共培養(yǎng),并加入IFN-γ刺激,流式檢測(cè)LSK細(xì)胞向T前體細(xì)胞分化情況,以及向αβT細(xì)胞、γδ T細(xì)胞分化情況。8.流式細(xì)胞術(shù)分選出LSK細(xì)胞,體外IFN-γ刺激培養(yǎng),7-AAD標(biāo)記凋亡細(xì)胞,通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果1.IFN-y刺激的肝臟和骨髓單個(gè)核細(xì)胞、LSK細(xì)胞集落形成數(shù)量減少,且形成的集落較小。表明IFN-γ能夠明顯抑制肝臟和骨髓造血干細(xì)胞集落形成。2.IFN-γ刺激抑制IFN-γ缺失鼠、野生鼠的肝臟和骨髓單個(gè)核細(xì)胞集落形成能力,并且IFN-γ缺失鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞集落形成單位明顯大于野生鼠,而骨髓中差別不明顯。3.缺失IFN-y的小鼠肝臟和骨髓的造血干細(xì)胞LSK細(xì)胞、具有長(zhǎng)期造血能力的干細(xì)胞LT-HSC細(xì)胞、具有短期造血能力的干細(xì)胞ST-HSC細(xì)胞以及多潛能造血干細(xì)胞MPP細(xì)胞比例均增加。4.缺失IFN-γ的小鼠肝臟共同淋巴系祖細(xì)胞CLP細(xì)胞比例呈增加趨勢(shì)。5.缺失IFN-γ的小鼠肝臟T前體細(xì)胞群DN1～DN4整體比例增加,而成熟αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞無(wú)明顯變化。6.體內(nèi)過(guò)表達(dá)IFN-y后小鼠肝臟及骨髓中LSK雖然上升,但是具有長(zhǎng)期造血能力的造血干細(xì)胞CD48-LSK細(xì)胞明顯降低。7.體內(nèi)過(guò)表達(dá)IFN-y后肝臟共同淋巴系祖細(xì)胞CLP細(xì)胞增加,而T前體細(xì)胞群比例不變,其中DN1比例上調(diào)且DN1細(xì)胞增殖能力下降。8.LSK細(xì)胞與OP9-DL1細(xì)胞共孵育能誘導(dǎo)分化到T前體細(xì)胞及分化到成熟的αβT細(xì)胞、yδT細(xì)胞。并且IFN-y刺激抑制LSK細(xì)胞向T前體細(xì)胞及γδ T細(xì)胞的分化進(jìn)程。9.IFN-γ刺激后LSK細(xì)胞的7-AAD陽(yáng)性細(xì)胞比例很小與未刺激組無(wú)差別。結(jié)論1.成年肝臟造血干細(xì)胞具有造血功能,且可以向γδT細(xì)胞方向發(fā)育分化。2.IFN-γ抑制肝臟和骨髓造血干細(xì)胞的集落形成能力,而對(duì)肝臟造血干細(xì)胞的影響更為明顯。3.IFN-γ抑制肝臟和骨髓造血干細(xì)胞由LT-HSC向ST-HSC和MPP發(fā)育分化的進(jìn)程。4.1FN-γ抑制肝臟和骨髓造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞、T前體細(xì)胞以及γδT細(xì)胞的發(fā)育分化。5.1FN-γ刺激不影響肝臟和骨髓造血干細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2395993