【摘要】：細(xì)胞程序性壞死(programmed necrosis,necroptosis)是近年來鑒定的一種新的細(xì)胞程序性死亡方式,在炎癥反應(yīng)、外源微生物入侵防御和胚胎發(fā)育等病理和生理過程中都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。多種因素都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死,其中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNFα)誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死目前研究的最為廣泛。TNFα是一種多功能的細(xì)胞因子,與細(xì)胞膜上的受體(TNFαreceptor 1,TNFR1)結(jié)合后促進(jìn)TNFR1胞內(nèi)段構(gòu)象發(fā)生改變,進(jìn)而招募并結(jié)合具有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白,如TRADD(TNF receptor 1 associated death domain)和RIP1(receptor-interacting protein 1),形成復(fù)合體I(complex I),進(jìn)而招募其他蛋白激酶,活化NFκB或MAPK信號通路,促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖。RIP1與TNFR1解離后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),招募并結(jié)合RIP3(receptor-interacting protein 3),形成”壞死復(fù)合體(necrosome)”,且兩者通過相互磷酸化或在其他蛋白的影響下磷酸化而激活,進(jìn)而招募并結(jié)合RIP3的底物蛋白MLKL(mixed lineage kinase domain like pseudokinase),促進(jìn)MLKL的磷酸化與多聚化,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上與磷脂酰肌醇相結(jié)合,破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死。RIP1是首個鑒定的細(xì)胞程序性壞死調(diào)控蛋白,其別構(gòu)抑制劑Necrostatin-1在細(xì)胞和疾病模型中都能顯著抑制細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。同時,敲低RIP1也能顯著抑制TNFα與Z-VAD聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast,MEF)、3T3(過表達(dá)RIP3)和HT29等細(xì)胞的程序性壞死,表明RIP1是啟動細(xì)胞程序性壞死的必不可少的靶蛋白。但是,近期研究發(fā)現(xiàn)敲低L929細(xì)胞內(nèi)的RIP1,并不抑制TNFα單獨或與Z-VAD聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,且這一現(xiàn)象在MEF細(xì)胞中得到進(jìn)一步驗證,表明在敲低RIP1的L929或MEF細(xì)胞中TNFα可以通過其他機(jī)制來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,但這種細(xì)胞死亡的類型、調(diào)控靶點與機(jī)制目前并不清楚。本研究以l929細(xì)胞為模型,利用慢病毒介導(dǎo)的rna干涉技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定敲低rip1及其他靶蛋白的l929細(xì)胞株,探索了tnfα誘導(dǎo)rip1非依賴性細(xì)胞死亡的調(diào)控靶點與機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)rip1敲低并不抑制tnfα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,且細(xì)胞凋亡抑制劑z-vad-fmk及caspase8敲低對細(xì)胞死亡過程中沒有抑制作用,表明rip1非依賴的細(xì)胞死亡不是凋亡,而是程序性壞死。同時,tnfα在誘導(dǎo)rip1非依賴的細(xì)胞程序性壞死促進(jìn)rip3及其底物蛋白mlkl的磷酸化和多聚化,且敲低rip3或mlkl能夠阻斷rip1非依賴的細(xì)胞程序性壞死,表明tnfα通過活化rip3/mlkl信號通路來誘導(dǎo)rip1非依賴的細(xì)胞程序性壞死。rip1可以通過結(jié)合tnfr1與rip3來形成不同的蛋白復(fù)合體,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞程序性壞死信號從tnfr1傳遞到rip3,但目前并無rip3與tnfr1直接結(jié)合的相關(guān)報道,因此,在敲低rip1的細(xì)胞中tnfα誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死信號如何從tnfr1傳遞到rip3目前并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)rip1敲低促進(jìn)rip3與tnfr1的結(jié)合,以及rip3與tradd的相互結(jié)合,但tradd敲低則阻斷rip3與tnfr1結(jié)合形成的蛋白復(fù)合體,表明tradd能夠介導(dǎo)rip3與tnfr1的結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞程序性壞死信號的傳遞。同時,我們發(fā)現(xiàn)敲低tradd能夠完全抑制tnfα誘導(dǎo)的rip1非依賴的細(xì)胞程序性壞死,以及rip3/mlkl信號通路的活化,表明tradd通過介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死信號的傳遞來啟動tnfα誘導(dǎo)的rip1非依賴的細(xì)胞程序性壞死。此外,我們發(fā)現(xiàn)敲低rip3能抑制tnfα與z-vad聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,但并不阻斷tnfα單獨誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,表明rip3敲低可導(dǎo)致tnfα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式由程序性壞死轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞凋亡。同時,在rip3非依賴的細(xì)胞死亡過程中檢測到caspase信號通路的活化,且敲低caspase8能完全阻斷rip3非依賴的細(xì)胞死亡,進(jìn)一步驗證了rip3非依賴的細(xì)胞死亡是細(xì)胞凋亡。由于敲低tradd能夠顯著抑制rip3非依賴的細(xì)胞凋亡,且tradd在細(xì)胞凋亡過程中能結(jié)合caspase8并促進(jìn)其活化,進(jìn)而激活caspase信號通路,表明tradd也是調(diào)控rip3非依賴的細(xì)胞凋亡的重要靶點,并通過活化caspase信號通路來啟動細(xì)胞凋亡。因此,本研究發(fā)現(xiàn)tradd是RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死的調(diào)控靶點,也是啟動RIP3非依賴的細(xì)胞凋亡的重要靶蛋白,分別通過活化RIP3/MLK信號通路和caspase信號通路來啟動RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死和RIP3非依賴的細(xì)胞凋亡,從而系統(tǒng)闡述了TRADD、RIP1和RIP3在TNFα誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡過程中的相互補(bǔ)充和相互調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步揭示了細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控靶點,闡明了細(xì)胞程序性壞死的調(diào)控機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 常喜喜;成祥;王麗麗;王宇;張毅;陳國柱;于繼云;;RIP1介導(dǎo)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡與程序性壞死[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2016年10期

2 吳晨露;謝南南;周伸奧;孫麗明;;程序性細(xì)胞壞死的分子機(jī)制及其在炎癥中的作用[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2016年01期

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本文編號：2379659