【摘要】：隨著癌癥化學(xué)治療藥物的效果不斷提高,癌癥患者的預(yù)后也隨之不斷改善。然而,由于化療引起的心肌病變卻成為癌癥患者不良預(yù)后的重要因素之一。阿霉素(多柔比星,Doxrubicin)屬于蒽環(huán)類藥物,是目前臨床常用的癌癥化療藥物。然而,阿霉素的使用會造成不可逆性的心肌損傷,最終導(dǎo)致心力衰竭。關(guān)于阿霉素致心肌損傷的確切機制相對復(fù)雜,近期研究認(rèn)為,線粒體損傷、氧化應(yīng)激、鈣超載和細(xì)胞遺傳毒性是阿霉素造成心肌損傷的主要機制。心肌損傷的發(fā)展過程是動態(tài)的,具有時間相關(guān)性。時序性基因表達(dá)分析為研究生命過程提供了時間維度的豐富信息,其中不僅包括靜態(tài)基因表達(dá)結(jié)果,還能夠表現(xiàn)基因表達(dá)的動態(tài)關(guān)系。因此,通過時序性基因表達(dá)分析,更全面的構(gòu)建疾病進(jìn)展的生物網(wǎng)絡(luò),表述致病機制,為藥物研發(fā)和臨床治療提供指導(dǎo)。本研究采用丹參作為研究載體,研究丹參中保護(hù)心肌抵抗阿霉素?fù)p傷的有效部位和成分及其作用機制,主要內(nèi)容包括以下四個方面:1、阿霉素?fù)p傷大鼠心肌時序性基因表達(dá)分析本文采用DrugMatrix數(shù)據(jù)庫內(nèi)阿霉素作用大鼠心肌實驗轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)果,通過GC穩(wěn)健多芯片平均化(GCRobust Multi-array Average,GCRMA)方法進(jìn)行芯片背景校正,獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果。以觀測時間點正常組作為對照,獲得阿霉素作用1天、3天和5天的差異化表達(dá)基因,篩選閾值為1.5倍表達(dá)倍率,p值小于0.05,三個時間點差異化表達(dá)基因共計815個。進(jìn)一步,采用短時序表達(dá)數(shù)據(jù)挖掘(Short Time-series Expression Miner,STEM)工具包進(jìn)行時間相關(guān)的基因表達(dá)模式分析,共呈現(xiàn)9種表達(dá)模式,對每類基因表達(dá)模式進(jìn)行GO功能富集分析,取各組別中主要作用基因共計196個;采用STRING數(shù)據(jù)庫搜索蛋白-蛋白相互作用,共計563個作用節(jié)點,構(gòu)建阿霉素?fù)p傷大鼠心肌作用機制動態(tài)生物網(wǎng)絡(luò),為接下來分析中藥活性成分作用機制提供了理論基礎(chǔ)。2、阿霉素?fù)p傷大鼠H9C2心肌細(xì)胞模型建立基于第一部分阿霉素?fù)p傷機制分析,通過高內(nèi)涵實時細(xì)胞熒光技術(shù)建立阿霉素?fù)p傷大鼠H9C2心肌細(xì)胞模型,獲得多種與細(xì)胞健康程度相關(guān)參數(shù),包括線粒體損傷、鈣離子超載和遺傳毒性,從多方面同時表現(xiàn)阿霉素造模情況。選取自由基清除劑依達(dá)拉奉作為陽性化合物,通過H9C2細(xì)胞評價了依達(dá)拉奉的心肌毒性量效關(guān)系,同時評價了依達(dá)拉奉保護(hù)H9C2細(xì)胞抵抗阿霉素作用的量效關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10 μ依達(dá)拉奉能夠抑制阿霉素引起的細(xì)胞凋亡和鈣超載現(xiàn)象,但對阿霉素引起的遺傳毒性無明顯作用。為進(jìn)一步對丹參有效部分和成分發(fā)現(xiàn)奠定了實驗基礎(chǔ)。3、丹參餾分制備及成分含量測定本文以丹參為研究載體,建立了高效液相色譜外標(biāo)法測定丹參種14種成分,包括丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、金合歡素、丹酚酸D、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、鼠尾草酚、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮、丹參酮ⅡA、齊墩果酸含量方法,并經(jīng)過方法學(xué)考察。比較了甲醇提取和20%甲醇-水提取方法,結(jié)果表示,甲醇能夠充分獲得丹參成分。通過液相色譜轉(zhuǎn)換方法,將分析液相方法轉(zhuǎn)換至微量制備液相,結(jié)合丹參提取物含量測定結(jié)果,制備丹參醇提物餾分。對獲得的6個丹參餾分進(jìn)行含量測定,以丹酚酸B作為指標(biāo)成分,折算后得到丹酚酸B摩爾濃度為4.02 mmol/L,可用于進(jìn)一步餾分活性驗證實驗。4、丹參餾分及中藥小分子活性篩選及作用機制解析采用H9C2細(xì)胞驗證6個餾分的細(xì)胞毒性作用,并采用阿霉素?fù)p傷大鼠H9C2心肌細(xì)胞模型評價各個餾分保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)餾分1和餾分2具有一定的心肌保護(hù)活性。選取課題組中藥小分子化合物庫中常見中藥成分76個與丹參中14種指標(biāo)成分組成備選化合物,采用阿霉素?fù)p傷大鼠H9C2心肌細(xì)胞模型進(jìn)行高通量篩選,對獲得的6個細(xì)胞活性相關(guān)參數(shù)采用主成分-K均值分類模式識別,共獲得8種作用模式,其中丹參中單體化合物與依達(dá)拉奉有相似作用的有丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、金合歡素、丹酚酸A、二氫丹參酮�；钚猿煞謫误w主要分布于餾分1和餾分2中,與餾分活性結(jié)果相符。進(jìn)一步分析單體作用機制,基于課題組前期對丹參中小分子化合物藥效靶點預(yù)測和數(shù)據(jù)庫整理,提取活性丹參小分子靶點,與第一部分生物網(wǎng)絡(luò)中蛋白匹配,發(fā)現(xiàn)主要作用靶點為MMP2、ALOX15、APP、CYP2E1,對主要作用靶點和動態(tài)生物網(wǎng)絡(luò)中一級節(jié)點基因進(jìn)行功能富集分析,發(fā)現(xiàn)丹參發(fā)揮保護(hù)心肌作用成分來自極性較大部位,主要機制是通過抑制凋亡過程,減輕缺氧反應(yīng)。本文以丹參為研究載體,基于時序性基因表達(dá)分析結(jié)果和細(xì)胞學(xué)驗證實驗,從單體-餾分層面探討并驗證了丹參保護(hù)心肌抑制阿霉素?fù)p傷的有效部位和作用機制,為從分子層次和系統(tǒng)層面上揭示中藥復(fù)雜成分體系作用機理提供方法學(xué)支持。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 WANG Wei;LIANG You-Sheng;;Artemisinin:A wonder drug from Chinese natural medicines[J];Chinese Journal of Natural Medicines;2016年01期

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本文編號：2374725