【摘要】：背景：人副流感病毒3型(human parainfluenza virus 3, HPIV3)是一種含有不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA基因組的包膜病毒,為副粘病毒科(paramyxoviridae)副粘病毒屬(paramyxovirus)的家族成員之一。在全球范圍內(nèi),HPIV3主要引起5歲以下嬰幼兒的上下呼吸道感染,例如肺炎、細(xì)支氣管炎、喉炎等。當(dāng)前仍沒(méi)有安全有效的疫苗和抗病毒藥物來(lái)預(yù)防和治療該病毒引起的感染,而開(kāi)發(fā)疫苗和藥物的主要障礙在于對(duì)該病毒感染宿主細(xì)胞的機(jī)制還不清楚,因此必須進(jìn)一步弄清HPIV3的致病機(jī)制。HPIV3入侵宿主細(xì)胞的先決條件為病毒包膜和宿主細(xì)胞膜的融合,同時(shí)細(xì)胞膜之間的融合也是HPIV3入侵宿主細(xì)胞的典型病理特征,該過(guò)程主要是通過(guò)同源性血凝素-神經(jīng)氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase, HN)蛋白協(xié)助,由融合(fusion, F)蛋白介導(dǎo)完成的。F蛋白為型病毒糖蛋白,最初合成的是非活化的蛋白前體F0,經(jīng)過(guò)加工修飾后被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解為二硫鍵連接的F1和F2。研究表明F蛋白上的多個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)δと诤匣钚杂兄匾饔�。其中融合�?fusion peptide, FP)能夠插入宿主細(xì)胞膜中從而啟動(dòng)膜融合過(guò)程；兩個(gè)疏水性的七重復(fù)基元(heptad repeat motif,HR),即HRA和HRB,具有很強(qiáng)的親和力,能夠在膜融合過(guò)程中形成穩(wěn)定的6-螺旋束(six-helical bundle,6HB)促進(jìn)病毒包膜和靶細(xì)胞膜的融合；而跨膜區(qū)(transmembrane region, TM)為形成融合小孔所必須。在HRA和HRB之間有大約250個(gè)氨基酸(amino acid, aa),主要包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域(DⅠ-DⅢ)和兩個(gè)連接區(qū)(DⅠ-DⅡ連接區(qū)和HRB連接區(qū))。DⅠ-DⅡ連接區(qū)(369aa-374aa)連接結(jié)構(gòu)域DⅠ和DⅡ,HRB連接區(qū)連接結(jié)構(gòu)域DⅡ和HRB。當(dāng)前只有HPIV3 F蛋白融后合構(gòu)象的X-射線晶體結(jié)構(gòu)是已知的,且HRA、HRB、結(jié)構(gòu)域DⅠ-DⅢ和兩個(gè)連接區(qū)均可在該結(jié)構(gòu)上觀察到。到目前為止,雖然已有F蛋白的多個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)δと诤匣钚杂绊懙膱?bào)道,但DⅠ-DⅡ連接區(qū)對(duì)膜融合活性的影響還未有報(bào)道。目的：確定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對(duì)膜融合活性的影響,探討DⅠ-DⅡ連接區(qū)影響膜融合功能的機(jī)制,以期為研究安全有效的疫苗和抗病毒藥物提供線索。方法：1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL軟件上以PIV5(parainfluenza virus 5, PIV5) F蛋白融合前構(gòu)象的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:4GIP)為模板得到HPIV3 F蛋白的融合前構(gòu)象的模型,以確定DⅠ-DⅡ連接區(qū)在融合前構(gòu)象上的位置。2.采用定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法構(gòu)建出該區(qū)域(369aa-374aa)的九個(gè)單氨基酸突變體,測(cè)序確定構(gòu)建成功后將它們?cè)谡婧怂矔r(shí)表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)。3.采用三種不同類(lèi)型的膜融合試驗(yàn),即吉姆薩染色法,指示基因法,染料轉(zhuǎn)移法,定性和定量檢測(cè)各突變體蛋白對(duì)膜融合功能的影響。4.采用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率。5.采用免疫共沉淀試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力。6.采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用Student's t-檢驗(yàn)對(duì)突變體和野生型F蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較,P0.05被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.成功構(gòu)建出HPIV3 F蛋白融合前構(gòu)象的同源結(jié)構(gòu)模型,通過(guò)氨基酸序列比對(duì)確定了HPIV3 F蛋白融合后構(gòu)象的DⅠ-DⅡ連接區(qū)(369-374aa)在它的融合前構(gòu)象中仍然扮演DⅠ-DⅡ連接區(qū)的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)的9個(gè)單氨基酸突變體(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均構(gòu)建成功。2.各突變體F蛋白在膜融合過(guò)程的所有階段均表現(xiàn)出降低的膜融合活性。與野生型蛋白相比,突變體F蛋白形成的合胞體不僅數(shù)目減少而且面積也較小,其中K369E、S370A、V373A、V373T和P374T突變體幾乎喪失了形成合胞體的能力,僅為野生型的5%以下,內(nèi)容物混合的能力也極度降低,分別為野生型的18.0%、17.3%、 16.4%、18.9%和15.4%,同時(shí)它們的半融合活性也大幅度降低,半融合的速率和程度均低于野生型水平的15%；而剩下的4個(gè)突變體(K369A、D371A、I372A和P374A)雖具有合胞體形成能力,但均低于野生型水平,其中K369A和D371A突變體內(nèi)容物混合的能力均約為野生型的66.7%,半融合的速率和程度約為野生型水平的五分之四(82.2%、82.0%)和四分之三(74.5%、75.2%),而1372A和P374A突變體內(nèi)容物混合的能力分別為野生型的水平的57.6%和54.5%,半融合的速率分別降低到野生型水平的58.5%和51.8%,半融合的程度分別降低為野生型的62.6%和60.6%。3.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的突變對(duì)F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平無(wú)影響。各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平均處于野生型F蛋白的93.1%-105.9%之間,與野生型相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的各突變體與HPIV3 HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力均降低,其中K369E、V373A、V373T和P374T這4個(gè)突變體幾乎喪失了與HN蛋白相互作用的能力,均低于野生型水平的10%；S370A突變體與HN蛋白相互作用的能力約為野生型的五分之一；K369A、D371A、I372A和P374A突變體與HN蛋白相互作用的能力分別為野生型的41.4%、66.0%、26.9%和15.2%。結(jié)論：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對(duì)膜融合功能有重要影響,且各氨基酸殘基對(duì)膜融合活性影響的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突變導(dǎo)致各突變體F蛋白與同源性HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力降低所致。背景：HPIV3入侵宿主細(xì)胞是通過(guò)病毒包膜和靶細(xì)胞膜的融合來(lái)實(shí)現(xiàn)的,該過(guò)程能將單負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA基因組導(dǎo)入宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi),是病毒完成生命周期的關(guān)鍵步驟。HPIV3包膜上有兩種與膜融合相關(guān)的糖蛋白,即HN蛋白和F蛋白,兩者協(xié)同完成了該過(guò)程。HN蛋白負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞表面的吸附,而F蛋白則直接介導(dǎo)膜融合過(guò)程。在F蛋白HRA和HRB之間有一段過(guò)渡性的區(qū)域,主要包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域DⅠ,DⅡ和DⅢ,它們通過(guò)連接區(qū)相連。DⅠ和DⅡ結(jié)構(gòu)域由DⅠ-DⅡ連接區(qū)(369aa-374aa)連接；DⅡ和HRB結(jié)構(gòu)域由HRB連接區(qū)連接；D1和D3結(jié)構(gòu)域直接相連,兩者之間并沒(méi)有氨基酸序列連接,所以我們定義為“偽連接區(qū)”,對(duì)該區(qū)域的氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其含有亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)。亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)是一種特殊的類(lèi)七重復(fù)基元結(jié)構(gòu),最顯著的特征是亮氨酸或異亮氨酸總是有規(guī)律地每隔6個(gè)氨基酸就出現(xiàn)一次,將該氨基酸序列用假想的α螺旋輪展示時(shí),第“a”位的全部氨基酸殘基和第“d”位的大部分氨基酸殘基均為非極性氨基酸。對(duì)三種不同副粘病毒融合蛋白亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)的研究表明該基序?qū)δと诤匣钚杂兄匾绊憽Ｈ欢挥贖PIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)的亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)對(duì)膜融合活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。目的：確定HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)對(duì)膜融合活性的影響,尋找亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)干擾膜融合功能的機(jī)制。方法：采用PCR定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法將該區(qū)域的亮氨酸和其它保守氨基酸(L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299)分別突變?yōu)楸彼?同時(shí)將中間的三個(gè)高度保守的亮氨酸(L271、L278和L285)進(jìn)行了聯(lián)合突變,應(yīng)用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)于BHK-21細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá),之后采用合胞體形成試驗(yàn)、內(nèi)容物混合試驗(yàn)、R18探針試驗(yàn),半融合動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)突變對(duì)膜融合功能的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平；采用免疫共沉淀試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)突變對(duì)HN蛋白和F蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力的影響。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用Student's t-檢驗(yàn)對(duì)突變體和野生型F蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較,P0.05被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.應(yīng)用PCR單點(diǎn)突變和聯(lián)合突變的方法成功構(gòu)建出了HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)的7個(gè)單點(diǎn)突變體(L257A、V264A、L271A、 L278A、L285A、Q292A和I299A)、3個(gè)二聯(lián)突變體(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1個(gè)三聯(lián)突變體(L271A-L278A-L285A)。2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達(dá)時(shí),在膜融合過(guò)程的所有階段均表現(xiàn)出降低甚至消失的膜融合活性。與野生型相比,突變體蛋白形成的合胞體不僅數(shù)量減少而且面積也較小,3個(gè)單點(diǎn)突變體(L257A、L271A和I299A)和3個(gè)二聯(lián)突變體的合胞體形成能力極度降低,低于野生型水平的6.0%,內(nèi)容物混合的能力只有野生型水平的16.0%以下,且只觀察到極少量的半融合事件,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%；而V264A、L285A和Q292A這3個(gè)突變體的合胞體形成能力略微降低,分別為野生型水平的64.7%、69.1%和68.5%,內(nèi)容物混合的能力仍維持在野生型水平的85%左右,介導(dǎo)半融合能力輕微降低,半融合的速率分別為野生型的88.8%、87.6%和85.0%,半融合的程度分別為野生型的85.5%、87.2%和83.1%；此外,L278A突變體的合胞體形成能力約為野生型水平的38.1%,內(nèi)容物混合的能力只有野生型的一半,半融合的速率和程度分別為野生型水平的52.8%和60.6%；剩下的三聯(lián)突變體喪失了合胞體形成能力,內(nèi)容物混合能力僅為野生型的2.2%,也沒(méi)有觀察到半融合事件的發(fā)生,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%。3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)的各丙氨酸取代株在細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)水平均與野生型近似,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.所有的突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力均降低,其中三聯(lián)突變體沒(méi)有檢測(cè)到與HN蛋白的相互作用；3個(gè)二聯(lián)突變體與HN蛋白的相互作用能力約為野生型的一半；L257A.L271A和I299A突變體與HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30%:V264A.L278A.L285A和Q292A突變體與HN蛋白的相互作用能力分別為野生型水平的63.3%、65.1%、64.3%和66.7%。結(jié)論：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)的亮氨酸拉鏈類(lèi)似結(jié)構(gòu)對(duì)膜融合活性有重要影響；其中三聯(lián)突變體對(duì)膜融合活性的影響最大；該結(jié)構(gòu)的完整性是完成膜融合過(guò)程必不可少的。背景：HPIV3F蛋白屬于Ⅰ型病毒膜融合蛋白,通常先合成非活化的前體蛋白F0,然后在宿主細(xì)胞蛋白水解酶的作用下裂解為二硫鍵連接的F1和F2。已有研究表明F1亞單位上的FP、HRA和HRB能夠在細(xì)胞融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。值得注意的是,Yin等發(fā)現(xiàn)在副流感病毒5型(parainfluenza virus 5, PFIV5) F蛋白融合前構(gòu)象的X射線晶體結(jié)構(gòu)中HRB的N-端有一段電子密度較弱的區(qū)域,即HRB連接區(qū)。對(duì)新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) F蛋白HRB連接區(qū)的第454位谷氨酰胺(glutamine, Q)進(jìn)行氨基酸突變分析后發(fā)現(xiàn)其對(duì)膜融合活性有重要影響。Russell等在猴病毒5型(Simian virus 5, SV5) F蛋白HRB的N-端靠近HRB結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)內(nèi)構(gòu)建突變體發(fā)現(xiàn)第447位亮氨酸(leucine, L)和第449位異亮氨酸(isoleucine, I)是影響F蛋白融合功能和形成六螺旋束(6HB)的關(guān)鍵氨基酸,提示HRB連接區(qū)域可能具有類(lèi)似“開(kāi)關(guān)”F蛋白構(gòu)象折疊的作用；目前對(duì)HPIV3F蛋白HRB連接區(qū)對(duì)膜融合功能的影響尚不清楚。目的：確定HPIV3F蛋白HRB連接區(qū)對(duì)膜融合功能的影響,探討該區(qū)域影響膜融合功能的機(jī)制。方法：采用定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法將HRB連接區(qū)內(nèi)的T429、E432、1443和N446位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變,應(yīng)用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)于BHK-21細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá),之后采用吉姆薩染色法、指示基因法、染料轉(zhuǎn)移法檢測(cè)突變對(duì)膜融合活性的影響；采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用Student's t-檢驗(yàn)對(duì)突變體和野生型F蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較,P0.05被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.成功構(gòu)建了HRB連接區(qū)的6個(gè)突變體T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達(dá)時(shí),膜融合活性表現(xiàn)為兩種類(lèi)型。T429A、T429L和N446A這3個(gè)突變體形成的合胞體不僅個(gè)數(shù)少,而且面積也比較小,內(nèi)容物混合的能力也降低,只有野生型水平的36.6%、42.3%和15.2%,同時(shí)半融合活性只有野生型水平的34.8%、42.7%和12.4%；而E432A、I443A和N446S這3個(gè)突變體的膜融合活性均比野生型略增強(qiáng),分別相當(dāng)于野生型的109.4%、113.2%和118.6%,但半融合活性差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：HPIV3 F蛋白HRB連接區(qū)內(nèi)的氨基酸突變對(duì)細(xì)胞融合活性有重要影響,其中N446為關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373.13
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本文編號(hào)：2293796